出典:Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assayは、ショウジョウバエの食物摂取量を測定します。J. Vis. Exp.(2017年)。
このビデオでは、食物摂取量と無制限のショウジョウバエの好みを測定する行動法であるCApillary FEeder、またはCAFEアッセイについて説明しています。注目のプロトコルは、食品の送達とその摂取量の追跡に使用される液体充填キャピラリーからの蒸発を最小限に抑えてアッセイを実行する方法を示しています。
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方法論記事
キャピラリーFEeder(CAFE)アッセイ:ショウジョウバエの食物消費と好みを追跡する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
このプロトコルは、Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。
1. CApillary FEederアッセイの組み立てと実施
- 絶食が不要な場合は、タッピングまたはブローパイプで実験フライをアッセイに移します。蒸発を定量化するために、ハエのないコントロールバイアルを3つ必ず含めてください。
- 外側の開口部の1つを塞いでいるピペットチップ(2〜20 μL容量)を慎重に取り外し、最初に充填されたガラスキャピラリーの下端を挿入します。ピペットチップをキャピラリーの隣に戻して、キャピラリーを固定します。複数の食品溶液がテストされている場合は、それに応じてこの手順を繰り返します。
- 食物源が異なる高さ(蓋から3 - 4 cm)に配置されている場合に発生する可能性のあるバイアスを避けるために、すべてのバイアルの内側に毛細管の端を同じレベルに置きます。濾紙までの距離を保ち、誤って濾紙または食品源の異なる粘度に触れて毛細管が漏れるのを防ぎます。
- マーカーペンを使用して、色付きの液体の上端にラベルを付けます(マークの先頭)。さまざまなキャピラリーを識別できるようにするには、カラーコードまたはストライプコードを使用して個別にラベルを付けます。
- 格子状のインレイが付いたプラスチックの箱の中に複数の調製したCAFEアッセイを入れ、実験室の条件下で、または温度、光、湿度が制御された気候チャンバー(パラメータ:25°C、相対湿度60%、12時間/12時間の明暗サイクル)で、実験期間(例:3時間または数日)で、箱(図2A)を安全な位置に移します。
- アッセイを数日にわたって行うと底面の濾紙が乾くため、24時間ごとにスポンジブング(100 μL)を介して真水を適用し、アッセイ内の湿度を一定に保ちます。30 mL ddH2Oを充填した4つの別々のバイアル(高さ8 cm、直径3.3 cm)を湿度デバイスとして使用し、プラスチックボックス内のCAFEアッセイの隣に置きます。実験中に湿度制御された環境を作るために、プラスチックの箱のカバーを使用してください（図2A).
注:実験室条件下では、より広範な変動性が発生します。ただし、CAFEアッセイを室温(教室など)で実施することは可能です。蒸発を減らすために、加湿装置(濾紙、湿ったスポンジ栓の有無にかかわらず、充填された水バイアル、プラスチックボックスのカバー)の使用を強く推奨します（図2B)。 - 24時間ごとに長期実験のためにキャピラリーを新たに充填したものと交換します。各24時間の間隔の前に死んだハエをメモし、生きたハエの数を使用して次の期間のフライあたりの消費量を計算します。半月板の衰退を測定した後、古い毛細血管を廃棄します(2.1を参照).
注:3時間の実験では、死んだハエはほとんど見られません。4日間の研究で、通常1〜3匹の死んだハエが見つかります。 - アッセイの終了時またはキャピラリーを交換する前に、CAFEアッセイが直立した状態にある間に、キャピラリーの下部半月板(マークエンド)をマーカーペンでマークします。マークの終了が初期マーク (マークの開始) より下にない場合は、データを破棄します。蓋を外さないでください、メニスカスが変化する可能性があるためです。
- キャピラリーをアッセイから慎重に取り外し、データ収集のために保管します。ハエが餌にアクセスできないため、データを破棄しない場合は、毛細血管内の液体が下端に達したかどうかを確認します。バイアルごとにすべての毛細血管をグループとして収集します。ハエが逃げるのを防ぐために、カットされていないピペットチップをすべての開口部に挿入します。セットアップを分解し、バイアル、蓋、スポンジ栓を石鹸浴で洗い、室温で一晩乾燥させてさらに使用します
注:ハエは、アッセイ後にさらに分析することができます。目視または解剖顕微鏡で食物の摂取量を確認します。 - 同じ遺伝子型で少なくとも3日間、実験を繰り返します。
2. データの収集と分析
- キャピラリーのマークの開始とマークの終了との間の距離を、キャリパーまたは定規を使用して測定します。データをスプレッドシートに直接転送するには、USB (Universal Serial Bus) 接続のデジタル・キャリパー (図 1E) を使用します。測定後、キャピラリーを廃棄してください。
- 毛細血管のサイズを考慮して、食物の摂取量または蒸発量を計算します。たとえば、長さ 73 mm で 5 μL の食品溶液を含むキャピラリーについて考えてみます。メニスカスの14.6 mmの減少は、1 μL溶液の取り込みを反映しています。次の式を使用して食物摂取量を計算します:
食物摂取量(μL)=測定距離(mm)/ 14.6mm - 食物摂取に対する蒸発の影響を排除するには、ハエを含まない3つの(少なくとも)コントロールバイアルの平均蒸発を計算します。ハエによる食物消費について得られた値からこの平均値を差し引きます。
- フライあたりの総消費量を決定するには、次の式を使用します:
食物消費量(μL)=(食物摂取量[μL]-蒸発損失[μL])/バイアル内のハエの総数。長期実験の場合は、24時間間隔の開始前に生きているハエの数を使用してください。 - オスとメスのハエなど、体の大きさの違いを考慮するために、食物摂取を体重に正規化します(μL食物/ mgフライ)。
- データ分析には統計ソフトウェアを使用します。正規分布データの場合、スチューデントのT検定を使用して2つのハエグループ間の差を判断し、2つ以上のグループに対してANOVA(分散分析)と事後的なTukey Cramer検定を使用します。選択の状況では、ノンパラメトリックな1サンプル符号検定を使用してランダム選択の差を分析します。
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結果
図1:ショウジョウバエメラノガスターCApillary FEederアッセイ。A)ハエによる給餌アッセイ。湿らせた濾紙は、バイアルの底に水を供給します。実験中、4つの毛細血管が設けられます(反対側の毛細血管に赤と青の食品)。キャピラリーは2番目のピペットチップによって所定の位置に固定され、未使用の位置はピペットチップを使用して閉じられることに注意してください。フタの中央にある発泡スチロールのプラグで、空気の入れ替えが可能です。B)蓋の詳細図。カットされたピペットチップ(2〜20μL、赤い境界線)を未使用のポジションの円錐形の開口部に挿入し、2番目のピペットチップをカットチップに挿入して穴を閉じます。カットされたピペットチップはマイクロキャピラリーの配置を制御するために使用され、アンカットチップはキャピラリーをしっかりと保持するために使用されます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| バイアル(育種) | グライナーバイオワン | 960177 | www.greinerbioone.com |
| バイアル(CAFEアッセイ) | グライナーバイオワン | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFEアッセイ | 工房 | - | - |
| プラスチックボックス、低壁 | プラスタイム | 353 | www.plastime.it |
| プラスチックボックスのカバー | 工房 | - | - |
| 毛細血管 | ブラウブランド | Ref(リファレンス7087 07 | www.brand.de |
| ピペットのヒント | グライナーバイオワン | 771290 | www.greinerbioone.com |
| ろ紙サークル | ワットマン | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-ショ糖 | アプリケム | 57勝50敗1 | www.applichem.com |
| エタノールアブソリュート | VWRケミカルズ | 20,821,330 | www.vwr.com |
| 食用色素(赤、E124) | バックファン | 10027 | www.backfun.de |
| 食品着色料(青、E133) | バックファン | 10030 | www.backfun.de |
| 石鹸液(CVK8) | CVHの | 103220 | www.cvh.de |
| デジタルノギス | ギャラント | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| バイアル(育種) | 高さ9.8cm、直径4.8cm | ||
| バイアル(CAFEアッセイ) | 高さ8cm、直径3.3cm | ||
| Lid-CAFEアッセイ | 大学のワークショップで製造され、製図が提供されました このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 | ||
| プラスチックボックス、低壁 | プラスチック製のグリッドインレイは、8 x 10バイアルの位置用にカスタムメイドされました | ||
| プラスチックボックスのカバー | 寸法(37 x 29 x 18 cm) | ||
| 毛細血管 | DIN ISO 7550規格、IVDガイドライン98/79 EG、端部は研磨済み | ||
| ピペットのヒント | 外側の円のピペットは、蓋に合わせてカットされています | ||
| ろ紙サークル | 直径45 mmは、使用するバイアル用に折りたたむとうまく機能します | ||
| D(+)-ショ糖 | 有害ではない | ||
| エタノールアブソリュート | 引火性の高い液体と蒸気 | ||
| 食用色素(赤、E124) | 記載されていません | ||
| 食品着色料(青、E133) | 記載されていません | ||
| 石鹸液(CVK8) | 臭い中性石鹸 | ||
| デジタルノギス | |||
| 標準的なフライフード | (20L用) | ||
| 寒天 | 160グラム | ||
| ビール酵母 | 299.33 グラム | ||
| コーンミール | 1,200グラム | ||
| 糖蜜 | 1.6リットル | ||
| プロピオン酸 | 57.3ミリリットル | ||
| ニパギン 30% | 160ミリリットル |
