幼虫の切り身の準備:無傷の感覚ニューロンと関連する表皮細胞を視覚化する方法

要約

出典:Tenenbaum, C. M., Gavis, E. R. 感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身からのショウジョウバエの筋肉組織の除去。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、感覚樹状突起樹状突起形成(da)ニューロンとそれらに関連する表皮細胞を視覚化するために使用される幼虫の切り身を準備する方法について説明します。このプロトコールでは、細胞の形態を維持しながら体壁から筋肉組織を切除する方法を詳細に示しており、これにより、不明瞭なdaニューロンや表皮細胞の免疫染色と可視化が改善されます。

プロトコル

このプロトコルは、Tenenbaum and Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2016年)。

注:筋肉除去の手順（図1)は、前述の幼虫の切り身の調製方法の修正版です。筋肉の除去に先行するステップとその後のステップについて簡単に概説し、読者はBrent, et al., J. Vis. Exp. (2009) と Karim and Moore, J. Vis. Exp. の以前の研究を参照することができます。(2011)より詳細な説明を参照してください。

1. 冷たい生理食塩水で幼虫を解剖

します

1. 冷 HL3.1 生理食塩水または冷 Ca²⁺ フリー HL3.1 生理食塩水の希釈液を調製します(表 1)。幼虫をシリコンエラストマー皿に入れ、皿の底を覆うのに十分な冷たい生理食塩水を入れます.
   注:幼虫の解剖中に、Ca²⁺を含まないHL3.1生理食塩水と標準的なHL3.1生理食塩水を使用して実験することをお勧めします。カルシウムがないと、幼虫の筋肉の収縮が大幅に減少します。したがって、幼虫の切り身は、Ca²⁺フリーHL3.1生理食塩水で解剖すると操作が容易になる可能性があります。しかし、筋肉の収縮により筋肉と表皮の間に空間ができ、これによりこれらの組織間に鉗子が挿入されやすくなり、表皮の損傷のリスクが最小限に抑えられることがわかりました。その結果、表皮およびdaニューロンの完全性を維持するためには、標準的なHL3.1が好ましい場合があります。どちらの生理食塩水でも良好な結果が得られ、選択はユーザーに委ねられています。
2. 腹側を上にして幼虫を配置します。幼虫の腹側表面は腹部の歯状ベルトで識別でき、背側は前部から後部に走る一次幼虫の気管チューブで識別できます。幼虫を前後方向に伸ばし、昆虫ピンを使用して頭と尾をシリコンエラストマー解剖皿に固定します。細かい解剖ハサミを使用して、腹側の正中線に沿って、一方の端からもう一方の端に向かって切ります.
   注:この向きは、一般的に研究されているdaニューロンの背側クラスターを保持します。
3. 幼虫を切り開いたら、本を開くように四隅を解剖皿に固定します。鉗子を使用して、CNS、腸、気管などの内臓をつかんで取り除きます。フィレットがぴんと張っているが最大限に伸びないように昆虫ピンを調整します。
   注:筋肉は、分節境界で体壁に固定されています。筋肉は体壁の大部分を覆っていますが、背側正中線近くの狭い領域には存在しません。

2. 筋肉の除去

1. 筋肉組織が存在しない幼虫の背側正中線を見つけます。単一の鉗子プロングを、可能な限り平らな向きで筋肉組織の下に挿入できるように配置します。
2. 背側の正中線から始めて、セグメントの前方境界近くで、鉗子と表皮の間の接触を最小限に抑えるように注意しながら、鉗子の突起を筋肉と表皮の間に慎重にスライドさせます。
3. 鉗子を上に引っ張って、筋肉の体壁への付着を1つのアンカーポイントで壊します。残りの目的の半セグメントに対してこのプロセスを繰り返します。
   注:このプロトコルは、各daニューロン樹状突起フィールドの後部の保存を最適化します。樹状突起場の前部を保存するには、各セグメントの後端に鉗子の突起を挿入するのが最善です。
4. 幼虫の切り身がすべての方向に最大限に伸びるように、昆虫のピンを再調整します。
5. 切り身を解剖皿に固定したまま、PBSで冷たく準備したばかりの4%ホルムアルデヒドを使用して25分間固定します。
6. PBSで5回すすいでください。
7. 鉗子を使用して、表皮との接触を最小限に抑えながら、残りのアンカーポイントから筋肉組織を慎重に引き離します。
8. 解剖皿からフィレットを緩め、1.5mlの微量遠心チューブに取り出します。Karim and Moore, J. Vis. Exp. で前述したように、その後のすべての洗浄、ブロッキング、および免疫蛍光染色ステップを実行します。(2011年)。

結果

図1:筋肉除去手順の概要。幼虫を解剖し、シリコンエラストマー解剖皿に固定します。筋肉組織を切除するために、セグメント境界(2.2)近くの背側正中線から始めて、筋肉と表皮細胞層の間に1つの鉗子プロングが挿入されます。鉗子を上に引っ張って、筋肉と体壁の間の付着を壊します(2.3)。これを目的のセグメントに対して繰り返し、幼虫をホルムアルデヒドに固定します(2.5)。固定後、鉗子を使用して残りの筋肉組織を体壁から分離します(2.7-2.8)幼虫のキューティクルと表皮はオレンジ色、クラスIVのdaニューロンは緑、筋肉は赤で描かれています。(2.2)および(2.7)の挿入図は、単一の幼虫の半セグメントの断面図を表しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックして...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デュモン#5ピンセット	電子顕微鏡科学	72701-Dの
マイクロハサミ、8 cm、ストレート、5 mm刃、0.1 mmチップ	世界の精密機器	14003
Sylgard 184 シリコンエラストマーキット	ダウコーニング	3097358から1004	解剖プレート用
アウステルリッツ昆虫ピン、0.1 mm	ファインサイエンスツール	26002-10
Fostec 8375光源	アーティザンテクノロジーグループ	62792から4