幼虫リンパ腺解剖:ショウジョウバエ血球産生器官の分離

要約

出典:Reimels、TAおよびPfleger、CMショウジョウバエの幼虫のリンパ腺と血球を調べる方法。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、ハエの幼虫の造血の主要な部位であるショウジョウバエのリンパ腺について説明し、免疫組織化学と蛍光イメージングのために臓器を解剖してマウントするプロトコルの例を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Reimels and Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。

1. 幼虫リンパ腺免疫組織化学

注:リンパ腺は、幼虫の前端から約3分の1の長さで、背側の脳の少し下に位置しています。(図 1 B) の矢印を参照してください。リンパ腺は背側血管に隣接しており、最も簡単に解剖でき、口のフックまたは脳に取り付けられています。野生型の第3インスターリンパ腺は非常に小さな構造です。一次ローブの長さは約100〜200μmです。(図 2A を参照。

1. このアッセイでほぼ同じ発育段階の幼虫を得るには、雌が2〜6時間の一定期間産卵できるようにして、採卵を制限します。
2. リンパ腺解離
   1. 各実験条件について、1 mLの1x PBS(表1)を24ウェルプレートの1ウェルに添加します。
   2. 0.1% PBST(表1)を使い捨てのトランスファーピペットを使用して各ウェルに1滴加えます><。 注:Tween 20などの界面活性剤を添加して表面張力を下げ、組織をウェルの底に沈めます。
   3. プレートを氷の上に平らに置きます。
   4. 1x PBSで満たされた解剖皿ウェルで幼虫を収集します。
   5. 照明付きの実体顕微鏡ベースに清潔な解剖パッドを置きます。使い捨てのトランスファーピペットを使用して、0.01% PBST(表1)の小滴をパッドに置きます。1匹の幼虫をPBSTドロップに移して解剖します。
   6. 後端から約4分の1の長さ、背側を上にした1対の鉗子で幼虫を保持します。
   7. 別の鉗子を使用して、幼虫を保持している鉗子のすぐ前方にあるキューティクルをつかみます。口のフックが露出するまで、キューティクルを前端に向かってゆっくりと引っ張ります。
      注:内部構造を乱さずにキューティクルを剥がすことが目的です。
   8. キューティクルを放し、両方の鉗子を使用して幼虫を2つに切ります。PBSTドロップから後端を取り外します.
      注:キューティクルが口のフックまで剥がれない場合は、幼虫を2つに切り、後端を取り除きます。一方の鉗子を使用してキューティクルの端を保持し、もう一方のペアの鉗子を使用して口のフックを開口部に押し込みます。これにより、キューティクルが反転し、口のフックが露出します。これは、別の解剖方法としても使用できます。
   9. 1対の鉗子を使用してキューティクル(腹側キューティクル、背側キューティクルフラップ、またはその両方)を固定し、安定性を確保します。
   10. 別の鉗子を使用して、露出したマウスフックをつかみ、そっと引き出します。
       注:これにより、キューティクルが内部構造から分離されます。理想的には、目/触角の想像椎間板、脳、リング腺、および背側血管に隣接するリンパ腺は、口のフックに取り付けられたままになります。
   11. マウスフックを握ったまま、唾液腺や脂肪体、腸などの不要な構造物を丁寧に取り除きます
       注:脳が口のフックから分離した場合でも、リンパ腺はまだ脳に付着して収集されている可能性があります。この場合、口のフックの代わりに腹側神経索を保持します。
   12. 口のフックまたは腹側神経索をハンドルとして使用して、リンパ腺を含む解剖された複合体を氷上のウェルに移します。固定する前に30分を超えないようにしてください。
3. 固定および免疫組織化学
   1. 24ウェルプレートを実体顕微鏡ベースに置きます。
   2. p200ピペットを使用して、PBSTをウェルから慎重に取り出します.
      注:空の隣接する井戸は、廃棄物を一時的に堆積させるのに役立ちます。
   3. ウェルの側面に200μLの3.7%ホルムアルデヒド(表1)を静かに加え、プレートを渦巻かせて、解剖した組織が完全に沈むようにします。
   4. プレートを氷に30分間戻します。リンパ腺が蛍光タンパク質を発現している場合は、光退色を防ぐためにプレートを覆ったままにしてください。
   5. p200ピペットを使用して、固定剤を慎重に取り外します。
   6. 1x PBS200 μLをウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーに室温で5分間置いて洗浄します。p200ピペットを使用して、PBS.
      を慎重に取り外します 注:固定されたリンパ腺は、すべての実験条件のリンパ腺が解剖されて固定されるまで、PBSの氷の上に残すことができます。
   7. 洗濯手順をさらに2回繰り返します。
   8. 200 μlの透過処理溶液(表1)をウェルに加えます。プレートを軌道シェーカーに45分間RT.
      でセットします 注:リンパ腺透過化の「ゴールドスタンダード」は45分ですが、著者はわずか20分で成功しています。
   9. p200ピペットで溶液を取り出します。
   10. 一次抗体を抗体溶液(表1)で、プロバイダーの仕様に従って希釈します。300 μLの一次抗体溶液をウェルに加え、解剖した組織が完全に沈んでいることを確認します。4°Cで一晩インキュベートします。
   11. p200ピペットを使用して一次抗体を取り出します。
   12. 1x PBS200 μlをウェルに加え、プレートをオービタルシェーカーに室温で10分間置いて洗浄します。p200ピペットを使用して、PBSを慎重に取り外します。
   13. 洗濯手順をさらに2回繰り返します。
   14. 二次抗体は、プロバイダーの仕様に従って抗体溶液で希釈します。300 μLの二次抗体溶液をウェルに加え、解剖した組織が完全に沈んでいることを確認します。オービタルシェーカーでRTで少なくとも2時間インキュベートします。
   15. p200ピペットを使用して二次抗体を取り出し、ステップ1.3.12および1.3.13の説明に従って洗浄します。最終洗浄後はPBSを取り外さないでください。
4. リンパ腺の取り付け
   1. 70%エタノール(表1)とティッシュワイプを使用したきれいなガラス顕微鏡スライド。
   2. 各実験条件について、スライドガラス上に1滴のマウントバッファー(表1)を置きます.
      注:1つのスライドに2つの条件が適合します。装着バッファーの量は、装着するリンパ腺の数によって異なります。リンパ腺約18〜20個に2μl、10〜12個に1μl、5個以下に0.5μlをご使用ください。
   3. 顕微鏡スライドを照明付きの実体顕微鏡ベースに置きます。
   4. 一度に最大2つの条件で、マウスフックまたは腹側神経索をハンドルとして使用して、鉗子を使用してすべてのリンパ腺をウェルから取り付けバッファーに移します。
   5. 解剖した組織を円形または長方形に均等に配置し、その過程で取り付けバッファーを広げます。
   6. 解剖された組織ごとに、個別に、鉗子の1つのトングを背側血管の下にスライドさせ、取り付けバッファーの周囲に向かってゆっくりと引っ張ります.
      注:これにより、解剖された組織の残りの部分からリンパ腺が引き出され、ガラス上のリンパ腺が平らになります。
   7. 鉗子の1つのトングとのこぎりの動きを使用して、リンパ腺と脳の間の背側血管を切断します。
   8. 解剖された組織の残りをリンパ腺の反対側、バッファーの最も外側の端に移動します.
      注:望ましくない解剖された組織は、最終的にリンパ腺の周囲に周囲を形成し、カバーガラスを載せるためのサポートとして機能します。
   9. すべてのリンパ腺が解剖された組織から分離されるまで繰り返し、不要な解剖された組織の1つを中央に配置するために予約します。
   10. 2本の指の間にカバースリップを取ります。カバーガラスにほこりや指紋がないことを確認してください。必要に応じて、ティッシュワイプと70%エタノールを使用してカバースリップを清掃します。
   11. カバースリップの端がスライドガラスの端と平行であることを確認し、カバースリップを取り付けバッファーの上に慎重に下げます。
       注:顕微鏡スライドは、イメージング前に4°Cで保存できます。最大保存時間は、使用する抗体の安定性によって異なります。24ウェルプレートはすすぎ、再利用できます。

2. イメージング

1. 固定された血球と装着されたリンパ腺を、メーカーの操作マニュアルに従って、適切な標準蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で20倍以上の倍率で画像化します。標準的な実体顕微鏡で幼虫全体を2倍の倍率で撮影します(メーカーの取扱説明書に従って)。
2. 必要に応じて、ソフトウェアプロバイダーの指示に従ってデコンボリューションします。

結果

図1:In vivo結晶細胞のメラニン化。A)幼虫は、加熱前にPCRチューブに個別に入れました。赤い矢印は、チューブの底にいない幼虫を示しています。B)加熱後の典型的な結晶細胞のメラニン化パターンで、リンパ腺が現れることがあります(矢印;背側が示され、前方が左)。スケールバーは1mmを表しますこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSタブレット	MPバイオメディカル	2810305
皿を解剖する	コーニング	7220-85
マイクロ遠心チューブ	デンビル	C2170
Sylgard 184キットから作られたシリコン解剖パッド	クレイデン(フィッシャーを通じて配布)	NC9644388(フィッシャーカタログ番号)	シルガードエラストマーキットの成分をメーカーの指示に従って混合することにより、シャーレで作られています。
実体顕微鏡	Morrell Instruments(ニコンディストリビューター)	MNA42000、MMA36300	ニコンモデルSMZ1000およびSMZ645
ティッシュワイプ	VWRの	82003-820
鉗子	電子顕微鏡科学	72700-DZの
P200ピペット	エッペンドルフ	3120000054
ホルムアルデヒド	漁夫	BP531-500
トライトン	漁夫	BP151-500
トゥイーン 20	漁夫	BP337-500
ウシ血清アルブミン	ロッキーマウンテンバイオロジカルズ	BSA-BSH-01K
通常のヤギ血清	シグマ	G9023-10ミリリットル
ノーマルドンキーセラム	シグマ	D9663-10ミリリットル
200プルーフエタノール	VWRの	V1001
N-プロピルガレート	MPバイオメディカル	102747
グリセロール	VWRの	EM-4750
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)	漁夫	62248
顕微鏡カバーガラス、18 mm円形	漁夫	12-545-100
ガラス顕微鏡スライド	漁夫	〒22-034-980
24ウェルプレート	コーニング	351147
使い捨てトランスファーピペット	漁夫	午前13-711-9時
蛍光顕微鏡	ツァイス		アクシオイメージャー.Z1

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