このプロトコルは、Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。
1. 解剖ステーションの準備
- 実体顕微鏡と光ファイバーグースネックが取り付けられた光源を大きなベンチトップに配置します。安定した手の動きを促進し、解剖中の手の「シェイク」を減らすためには、顕微鏡の周囲に十分な手と腕のレストスペースを確保することが不可欠です。顕微鏡の両側に約8〜10インチ、顕微鏡の底面とベンチの端との間に約4〜6インチがあることを確認します。
- ガラス製の9ウェル皿または3ウェル皿の2ウェルまたは3ウェルに1.0 mLのPTNバッファー(0.1 M リン酸ナトリウムバッファーpH 7.2、0.1%非イオン性界面活性剤、完全なバッファー成分については表の材料を参照)を充填し、氷上の解剖ステーションの隣に置きます。新たに解剖された脳はこの皿に移され、固定ステップまで保存されます.
注:ライブイメージングが必要な場合、解剖バッファーは 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または HL3 バッファーである必要があります。細胞内タンパク質の局在化が必要な場合、PBSは解剖および固定のための代替バッファーとしても使用できます。固定後、0.1%または0.3%の非イオン性界面活性剤を含むPTN洗浄剤を使用して、細胞膜の透過化を行う必要があります。
- PBSを解剖および固定に使用する場合は、マイクロ遠心チューブへの移管中に脳がプラスチックピペットチップに固執するのを防ぐために、ピペットチップを少なくとも1回は洗剤含有バッファー(PTNなど)ですすぐ必要があります。
- 空の35mmガラスまたはプラスチックのペトリ皿を使用して、シリコーンエラストマーを含む解剖皿を構築します。簡単に言えば、メーカーの指示に従ってエラストマー成分を混合し、35 mmの皿に注ぎ、平らな面で一晩重合させます。解剖皿を含むエラストマーは、鉗子とガラス皿などの硬い表面と接触すると簡単に損傷する可能性のある解剖鉗子の細い先端を保護するために使用する必要があります。また、市販のシリコンコーティングディッシュをオンライン小売店から定期的に購入しています。解剖中のコントラストを高めるために、不活性炭を含む(したがって黒く着色された)シリコーンエラストマー解剖皿が特に有用です。
2. 成人脳解剖の手順
- 3〜5日齢の成虫D.メラノガスターをCO2で、または氷を使用して麻酔します。氷を使用する場合は、ハエの入ったバイアルを逆さまにして(プラグの端を下にして)氷のバケツに~5分間入れます。バイアルを逆さまにして氷の中に置くと、ハエが食品に詰まるのを防ぎます。ハエに麻酔をかけたら、ハエを氷の中にある冷たい金属パッドまたはシャーレ、またはCO2を放出するハエパッドの上に置きます。脳を解剖して神経変性を分析する場合、古いハエも使用できます。
- トランスファーピペットまたはp200ピペットを使用して、解剖皿の中央に少量(150〜200μL)のPTNを置き、PTNの「泡」を作ります。解剖皿を実体顕微鏡の下に置き、PTNの泡が視野を満たし、均一に照らされるように照明と焦点を調整します。
- フライを操作して、金属またはCO2パッドの上に横たわった状態で「腹を上にする」(つまり、腹側を上にする)ようにします。
- #5鉗子の1対を使用して、解剖するハエの腹部をつかみ、ハエをつかんだまま、解剖皿のPTNに完全に浸します
注:プロトコルの残りの部分では、ヘッドがPTNに沈んでいる間にすべてのステップを実行する必要があります。
- #5鉗子の2番目のペアを使用して、ハエの吻の基部をつかみ、鉗子の2つのペアを引き離してハエの頭を体から取り外します。腹部と胸部を捨てます。このステップでは、ヘッドが解放されず、PTNの表面に浮かぶようにすることが重要です。頭が浮いてしまうと、脳を潰さずに再びつかむのは非常に難しいです
注:この方法を用いると、脳と腹側神経索の接続が切断されます。CNSのこれらの領域間の無傷の接続が必要な場合は、別の解剖プロトコルに従う必要があります。.ヘッドが取り除かれる前にテングがフライヘッドから外れると、テングがあった場所に穴が開いてしまいます。この場合、片方の目に近い穴の端でフライヘッドをつかみます。次に、適度な力でヘッドを取り外し、2対の鉗子を互いに引き離します。時折、頭部を体から取り外すと、腸および/または腹側神経索が頭部に付着したままになるため、解剖を続ける前に取り外す必要があります。
- 一方の鉗子は吻をつかみますが、もう一方のペアは右のハエの目の内側の端をつかむ必要があります。ゆっくりと、鉗子を互いに引き離します。この手順は、少量の安定した横方向の力で実行する必要があります。鉗子がゆっくりと互いに離れて移動するにつれて、吻は頭から引き離され、頭のキューティクルに中央の穴を作る必要があります。右目の内側部分を2番目のペアから解放せずに、最初の鉗子のペアでテングを破棄します。
注:成虫のD. melanogasterの脳は、ハエの頭の尾側(すなわち、後部/後部)領域にあります。したがって、頭のその領域をつかむことは避けるべきです。理想的には、内側網膜近くの頭の吻側(つまり、前部)部分のみを鉗子で直接つかむ必要があります。これで、脳と関連する気管がキューティクルの中央の穴から見えるようになります。このとき、穴から突き出ている白い糸状の気管の糸は取り外して廃棄することができます。
- 2対目の鉗子で、左網膜の内側の端(頭のキューティクルの中央の穴の端)をつかみます。網膜と関連するキューティクルを取り除くには、鉗子を180°の角度でゆっくりと引き離します。網膜が下にある視神経葉から解離すると、緊張がわずかに減少するのを感じるはずです。視葉の破れを防ぐためにゆっくりと進めます.
注:このステップで鉗子を急激に分離すると、視神経葉が裂けたり、キノコの体構造が乱れたりする可能性があります。時折、キューティクルは取り除かれますが、網膜の断片は視葉に付着したままになります。キノコの体を画像化する場合、網膜全体を切除する必要は必ずしもありません。ただし、他の脳領域(視神経葉の網膜ニューロン神経支配など)の分析では、で説明されているように網膜を完全に除去する必要がある場合があります。
注:網膜が脳の視神経葉からゆっくりと分離されるため、視神経葉は、白い糸状の気管で覆われた不透明な白い構造として観察できるはずです。1つの網膜を取り除いたら、それを廃棄することができます。網膜ニューロンの経路探索を分析するときは、このステップで視神経葉の損傷を防ぐために特に注意を払う必要があります。光受容体ニューロンの解剖とライブイメージングに焦点を当てた追加のプロトコルも利用可能です。
- 次に、目に見える気管をできるだけ慎重に取り除きます。気管にはすでに空気が含まれているか、後で空気が満たされている可能性があるため、脳が浮遊し、後の免疫染色ステップで失われる可能性があります。気管を取り除くには、非常に鋭い#5鉗子のペアを使用して脳から気管を取り除きます。
- 両方の鉗子ペアを使用して左フライ網膜の内側領域をつかむことにより、残りの網膜と周囲のキューティクルを切除します。網膜を慎重に半分に引き裂き、網膜とキューティクルの一部を取り除きます。場合によっては、脳を押しつぶさずに残りのキューティクルを取り除くことは特に困難であることが証明されています。これらの場合、腹側神経索の残りのストランドは、代わりに1対の鉗子でつかむことができ、もう一方のペアの鉗子を使用してキューティクルの最後を慎重に取り除くことができることがわかりました。
- p200ピペットを使用して、解剖した脳をPTNを含む9ウェルまたは3ウェルディッシュの1つのウェルに移動します。同じ遺伝子型の脳は、同じ井戸に一緒にプールされ、氷の上に置かれるべきです。脳組織は解剖後1時間以内に固定する必要があります。ブレインは小さなバッチで固定でき、より多くのブレインが必要な場合はプールできます。ほとんどの場合、経験豊富な研究者は通常、脳を解剖し、約3〜5分でガラスコレクションディッシュに移すことができます。
