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このプロトコルは、Koyle et al., Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2016年)。
1. 産卵ケージの準備
- 100 mlの水、10 gのビール酵母、10 gのブドウ糖、および1gの寒天を電子レンジで加熱して、ブドウジュース寒天プレートを作成します。ステップ1.1で3回沸騰させ、冷凍ブドウ濃縮液10gを加えて、寒天プレート上の卵の視認性を高めます。
- 寒天が55°Cに冷えたら、20 mlを100 mmのシャーレに注ぎ、固化させます。
- 寒天プレートの表面をイーストペーストで覆い、1gのビール酵母と15gの水を混ぜます。寒天プレートにイーストペーストを注ぎ、表面が覆われていることを確認してから、余分なものを注ぎ取り、薄いイーストの残留物を残します。複数のプレートを使用する場合は、ペーストを複数のプレートに順次注ぐことができます。
- 寒天プレートをケージの底に移します.
注:32オンスのデリコンテナは、アクリルフライケージの良い代替品です。
- 上部に穴を開け、その穴に通気性のあるメッシュを無毒の接着剤で接着して、32オンスのデリコンテナの蓋を作ります。接着剤が水溶性の場合は、蓋に水がかかるのを防ぎます。
- 200-300ハエを容器に移し、蓋で覆います。メッシュで保護された穴を空のシャーレ蓋で覆って寒天表面からの蒸発を防ぎ、必要に応じて蓋の内側に湿ったティッシュペーパーを追加します。ハエを25°Cで一晩16〜20時間インキュベートします。
2. 卵を集める
- ナイロンメッシュをプラスチックブッシングに入れて、採卵用のふるいを準備します。
- 卵が載ったプレートを取り出すには、空の容器に移してケージからハエを取り除きます。翌日同じハエを使用する場合は、すぐに新鮮な酵母のブドウジュース寒天プレートを含む新しいケージに移します。ハエは3〜5日間連続して使用できます
- 寒天を壊さないように注意しながら、きれいな絵筆で死んだハエを寒天から取り除きます。
- 寒天プレートを蒸留水ですすぎ、寒天表面から卵をやさしくブラッシングし、メッシュにスラリーを注いで卵を集めます。すべてまたはほとんどの卵が寒天プレートから取り除かれるまで、3〜4回繰り返します。
3. 卵のデコレーションと無菌食への移行
- バイオセーフティキャビネットは、内部(側面を含む)に70%エタノールを噴霧して準備します。底面を実験用ティッシュで拭き、フードをUVライトで~15分間滅菌します。すべての非生物学的供給品(試料カップ、絵筆、鉗子、廃棄物容器、400mlの滅菌水、および100mlの0.6%次亜塩素酸ナトリウム)をエタノールを噴霧して滅菌し、すぐにバイオセーフティキャビネットに入れます。UVライトで15分間滅菌します。
- 2回の次亜塩素酸ナトリウム洗浄のうちの最初の洗浄を開始するには、卵と一緒にブッシングを120mlの試料カップまたは他の滅菌容器に入れます。0.6% 次亜塩素酸ナトリウム溶液を ~90 ml をブッシングにゆっくりと注ぎ、縁のすぐ下まで注ぎます。
- 卵を2.5分間すすぎ、鉗子を使用して次亜塩素酸溶液中でブッシュを上下に動かすことにより、卵を定期的に再懸濁します。
- ブッシングを、バイオセーフティキャビネット内の90 ml漂白剤をあらかじめ充填した2つ目の試料カップに直接移します。
- バイオセーフティキャビネット内で手順3.3を繰り返します。2回目の漂白剤処理の終わりに、卵はブッシングの側面に付着し始めるはずです。
- バイオセーフティキャビネットで手順3.7〜3.8を実行します。
- 漂白剤を捨て、ブッシングを滅菌水で3回洗います。鉗子でブッシングを動かして、各洗浄中に卵を数回再懸濁します。3回目の洗浄が終わるまでに、ほとんどの卵はブッシングの側面に取り付けられているはずです。
- エタノールで滅菌した絵筆を使用して、ブッシングの側面から卵を滅菌食に移します。卵を個々に、または小さなバッチで移します。バイアルあたり30〜50個の卵を目指してください。酸素がチューブに入るのを防ぐために、キャップを緩めたままにしておきます。