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このプロトコルは、Koyleらの抜粋です。『Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions』、J. Vis. Exp.(2016年)。
1. 卵子のデコリオネートと無菌食への移行
- バイオセーフティキャビネットは、内部(側面を含む)に70%エタノールを噴霧して準備します。底面を実験用ティッシュで拭き、フードをUVライトで~15分間滅菌します。すべての非生物学的供給品(試料カップ、絵筆、鉗子、廃棄物容器、400mlの滅菌水、および100mlの0.6%次亜塩素酸ナトリウム)をエタノールを噴霧して滅菌し、すぐにバイオセーフティキャビネットに入れます。UVライトで15分間滅菌します。
- 2回の次亜塩素酸ナトリウム洗浄のうちの最初の洗浄を開始するには、卵と一緒にブッシングを120mlの試料カップまたは他の滅菌容器に入れます。0.6% 次亜塩素酸ナトリウム溶液を ~90 ml をブッシングにゆっくりと注ぎ、縁のすぐ下まで注ぎます。
- 卵を2.5分間すすぎ、鉗子を使用して次亜塩素酸溶液中でブッシュを上下に動かすことにより、卵を定期的に再懸濁します。
- ブッシングを、バイオセーフティキャビネット内の90 ml漂白剤をあらかじめ充填した2つ目の試料カップに直接移します。
- バイオセーフティキャビネット内で手順1.3を繰り返します。2回目の漂白剤処理の終わりに、卵はブッシングの側面に付着し始めるはずです。
- バイオセーフティキャビネットで手順1.7〜1.8を実行します。
- 漂白剤を捨て、ブッシングを滅菌水で3回洗います。鉗子でブッシングを動かして、各洗浄中に卵を数回再懸濁します。3回目の洗浄が終わるまでに、ほとんどの卵はブッシングの側面に取り付けられているはずです。
- エタノールで滅菌した絵筆を使用して、ブッシングの側面から卵を滅菌食に移します。卵を個々に、または小さなバッチで移します。バイアルあたり30〜50個の卵を目指してください。酸素がチューブに入るのを防ぐために、キャップを緩めたままにしておきます。バイアルが無菌性のままである場合は、昆虫インキュベーターに移します。それ以外の場合は、以下のようにバクテリアを追加します。
2. 4種類の細菌種を使ってノトバイオティクスのハエを作る
- バクテリアを調製する
- 手順1.1のように、必要な消耗品(ピペット、ピペットチップボックス、滅菌済み遠心分離管、MRSブロス、および試験管ラック)を備えた滅菌済みバイオセーフティキャビネットを準備します。試験管の外側をエタノールに浸した実験室用ワイプで拭いてから、バイオセーフティキャビネットに入れます。
- まず、500 μlの一晩分増殖物を滅菌マイクロチューブに移し、細菌をペレット化します。細菌密度が低い場合は、各チューブに最大1.5 mlを追加するか、上清を順番に除去して同じチューブに追加の培養物を追加します。バイオセーフティキャビネットからサンプルを取り出し、10,000 x gで10分間遠心分離します。サンプル間の汚染を避けるために、フィルターチップを使用してください。
- OD600を測定して、各培養物の密度を決定します。マルチウェルプレートリーダーを使用する場合は、各培養物200 μlを1倍、2倍、および4倍希釈の96ウェルプレートに移します。
- 各細胞ペレット(2.1.2)を希釈するmMRSの量を、プレート読み取り分光光度計と次の式を使用して決定します。各フライバイアルに50μlを接種するのに十分なブロスを追加するように計画してください。
- プレート読み取り分光光度計で、各細菌培養物の1:1、1:2、および1:4希釈のOD600測定値を収集します。OD600の値が0.1から0.2の間の細菌株ごとに希釈率を選択し、この値とそれに対応する希釈係数を2.1.4.2または2.1.4.3で与えられた式で「O」および「D」として使用します。
- ここで説明する4つの種を使用する場合は、細胞を同等のコロニー形成単位(CFU)/ml密度(OD600からCFUへの変換)に標準化します(以前にNewell and Douglas, Appl Environ Microbiolで決定されました)。(2014)) この式を使用して:
E = ((O-B) x V x D)/C
ここで、E =ペレットを再懸濁する容量(μl)、O = OD600バクテリア、B = OD600ブランク培地、D =倍希釈、V =μl遠心分離前の細菌培養、C = OD600の所定の定数。これらの方程式を使用した計算の例については、補足コード ファイルを参照してください。分光光度計が自動的にブランクになる場合は、「O-B」の代わりに「O」を使用します。
注:所定の定数(単位OD600、107 CFU ml-1に正規化、NewellおよびDouglas、Appl Environ Microbiol.(2014))は、A. tropicalis (0.052)、A. pomorum (0.038)、L. brevis (0.056)、L. plantarum (0.077) である。
- 他の細菌種を使用する場合(CFU/OD600定数は利用できません)、次の式を使用して密度をOD600 = 0.1に正規化します:
E = ((O-B) x V x D)/0.1 OD600
注:単位は、手順 2.1.4.2 と同じです。これらの方程式を使用した計算の例については、補足コード ファイルを参照してください。
- バイオセーフティキャビネットで、ピペットチップで上清を取り除き、ステップ2.1.4.2で計算したように、ペレットを新鮮なmMRSまたはPBSに再懸濁します。
- バクテリアを接種する
- 50 μlの細菌を、バイオセーフティキャビネット内の無菌食とデコレーション卵子と一緒に円錐管に移します。卵子移植後に細菌を添加して、バイアル間の汚染を防ぎます。
- 接種したチューブを25°Cのインキュベーターに入れます。
3. CFU負荷の測定/無菌性試験
- 全身のフライホモジネートのCFU負荷を測定するには、5匹のフライ(浸軟後5〜7日)を、125μlのセラミックビーズと125μlのmMRSブロスが入った1.7mlのマイクロフュージチューブに移します。組織ホモジナイザーを使用して、4.0 M/秒で30秒間フライを均質化します。
- あるいは、ビーズを省略し、プラスチック製の乳棒で微量遠心チューブで1分間手作業で均質化します。
- 腸内細菌叢を定量化する場合は、ハエの表面を滅菌して外因性微生物を除去します。100 μl 70%エタノールが入った微量遠心チューブに1分間移し、エタノールを吸引し、新しい微量遠心チューブに移して均質化します。腸のDNA含有量を測定する場合は、エタノール洗浄の前に0.6%次亜塩素酸ナトリウムで1分間すすぎます。
- ホモジネートを875 μl mMRSで希釈し、ボルテックスで5秒間ボルテックスし、120 μlのホモジネートをマイクロタイタープレートの最初のウェルにピペットで移します。
- 次の2つのウェルで、10 μlのホモジネートと70 μlのMRSを使用して、2回の1:8希釈を連続して行います。
- 第1ウェルから10μlを取り出し、70μlのMRSが入った第2ウェルに添加します。第2ウェルの内容物を十分に混合し、第2ウェルから10μlを70μlのMRSを含む第3ウェルに移し、十分に混合します。これにより、元の1,000 μlホモジネートは、希釈されていない、1:8、1:64の3つの濃度になります。
- 各希釈液10 μlをmMRSプレートに移します(必要に応じてマルチチャンネルピペットを使用)。皿を少し傾けて希釈液を寒天表面に数ミリメートル広げ、液体を乾かしてからプレートを動かします。プレートが2日経過すると、液体はプレート上で急速に乾燥し、隣接する2つの液滴の混合が減少します。
- 30°Cで1〜2日間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出します 明確な個々のコロニーが見え、10〜100個の分離されたコロニーで希釈してカウントします。
- E = C x D/P x V/Fの式を使用してフライあたりのCFUを計算します(E = フライあたりのCFU、C =カウントされたコロニーの数、D =希釈、P =μlメッキ、V =フライホモジネートの量、F =ホモジナイズされたフライの数)。