蛍光顕微鏡法のための昆虫の脚の処理:イメージングのための神経筋構造を保存する方法

Abstract

出典:Guan, W., et al. 成虫のキューティクルを通じてショウジョウバエの脚運動ニューロン軸索を視覚化します。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、ショウジョウバエの成虫の脚を解剖し、固定し、装着する方法を説明しています。その神経筋組織をそのまま保存して、画像解析のために使用します。

Protocol

このプロトコルは、Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2018年)。

1. 脚の解剖と固定

1. ガラス製マルチウェルプレートを用意し、70%エタノールを適数ウェルに充填します。15〜20匹のCO₂麻酔ハエ(性別と年齢に関係なく)を各ウェルに加え、ブラシを使用して、ハエが完全に沈むまでハエをエタノール溶液に軽くたたきます
   注:このステップは、キューティクルの疎水性を取り除くことです。キューティクルの自家蛍光が増加するため、1分以上洗わないでください。
2. ハエを0.3%非イオン性界面活性剤洗剤溶液で3回すすぎます(1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS))。フライをこの溶液に少なくとも10分間保持します.
   注:洗剤を入れると脚が固定されやすくなり、脚内部への固定剤の浸透が増加する可能性があります。
3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)のチューブとともにマルチウェルプレートを氷上に置きます
   注:16% PFAエタノールフリーのストック溶液から新鮮な4% PFAを調製することが重要です。
4. 鉗子を使用して、胸部や脚に損傷を与えることなくハエの頭と腹部を取り除きます。
   注:腹部を取り外すと、フライを保持したり、脚を解剖したりしやすくなります。
5. 鉗子で胸部から脚を切開し、4%PFAを含むウェルに脚を置きます。このためには、細い鉗子の先端を使用して、脚が外れるまで、肛門と胸部の接合部を優しく、しかししっかりと押します。
6. 脚部を4%PFAで4°Cで一晩(合計約20時間)固定します。
7. 脚を0.3%非イオン性界面活性剤洗剤溶液で1x PBSで5回、各20分間
洗浄します。
8. 洗浄バッファーを封入剤と交換してください。脚が完全に脚に浸透するように、取り付ける前に少なくとも1日は脚を封入培地に保管してください。
   注:封入剤の粘度が高い場合は、粘度の急激な変化によりキューティクルが崩壊し、脚の全体的な構造が損傷する可能性があるため、封入剤を1x PBSで80%に希釈してください。Gal4ドライバーにもよりますが、フライはマウントするまで4°Cの封入剤で1〜3週間保存できます。

2. 脚の取り付け

1. 顕微鏡スライドの左側に約20 μLの70%グリセロールを置き、正方形の22 x 22 mm²カバーガラス(図1A、B)で覆います。このカバースリップの右端に平行な線に沿って、このカバースリップから少し離れたところに、約10μLの封入剤をピペットで移します。スライドの右側にさらに30μLの封入剤を加えます(図1C).
   注:カバースリップを脚(下記参照)に塗布すると、封入剤はカバースリップの下と脚の周囲に緩やかに広がり、脚がずれることはありません。
2. 細い鉗子を使用して、脚を溶液から持ち上げ、左側のカバースリップ近くの封入剤に静かに置きます。各脚についても同じことを行い、上から下に揃えます (図 1D)。
   1. 鉗子の両先端の間に保持された媒体の滴で脚を持ち上げて移します。脚の向きは、外側を上または下にします。
3. すべての脚 (最大 6–8 本の脚を取り付けることができます) が適切に位置合わせされたら、このカバースリップが以前に配置したカバースリップ Figure 1E にわずかに載るように、2 番目のカバースリップを脚の上に置きます。これにより、カバースリップと組織の間にスペースを確保し、脚が損傷するのを防ぎます (Figure 1G).
   注:または、ステッカーウェルまたは歯列矯正ワックスを使用して、カバーガラスとスライドの間にスペースを作ります。
4. マニキュアを使用して、各コーナーでカバースリップの位置を固定します(図1F).
   注:これで、ティッシュをイメージングする準備が整いました。

Results

図1:顕微鏡スライドに脚を取り付ける手順。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
エタノールアブソリュート	漁夫	E/6550DF/17	絶対分析試薬グレード
非イオン性界面活性剤	シグマ・アルドリッチ	T8787	Triton X-100、分子生物学用
細い鉗子	シグマ・アルドリッチ	F6521	ジュエラーズ鉗子、デュモンNo.5
ガラスマルチウェルプレート	電子顕微鏡科学	71563から01	9キャビティパイレックス、100 mm x 85 mm
PFAの	サーモフィッシャー	28908	Pierc 16% ホルムアルデヒド (w/v)、メタノールフリー
グリセロール	フィッシャーバイオ試薬	BPの229から1	グリセロール(分子生物学)
スペーサー	孫進ラボ(株	IS006	iSpacer、4ウェル、ウェルあたり約12 μLの作業量、直径7 mm、深さ0.18 mm
正方形 22 mm x 22 mm カバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	FIS#12-541-B	No.1.5-0.16〜0.19mm厚
封入媒体	ベクターラボラトリーズ	H-1000	Vectashield 退色防止封入用メディウム