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このプロトコルは、Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。
注:特に断りのない限り、手順は室温で実行されます。温度制御インキュベーターは、特に断りのない限り、フライの飼育と交配の温度を維持するために使用されます。
1. 事前準備
- ハエを準備します。
- 前中期に富んだ卵子コレクション。
- 健康な、若い株または異種培養から透明な成虫のハエ。ボトルを25°Cで2日間熟成
注:一般的には、2本のヘルシーボトルで十分ですが、一部のクロスカルチャーではさらに多くのボトルが必要になる場合があります。
- 2日後、ボトルから~100〜300匹のメス(この時点では生後0〜2日)を集めます。女性は処女である必要はありません。バイアルの側面にイーストペーストを軽くたたき、30人の女性と10〜15人の男性をそれぞれイーストバイアルに入れます。バイアルを25°Cで2日間熟成させます。
- 中期濃縮卵母細胞コレクション。
- ストックまたはクロスカルチャーから~100〜300匹のメスを収集します。バイアルの側面にイーストペーストを軽くたたき、イーストバイアルにそれぞれ30匹の女性(男性は追加しない)を入れます。バイアルを25°Cで3〜5日間熟成させます。
- Prepare Solutions.
注:溶液は、特に断りのない限り、室温で無期限に保存できます。
- 改変ロブ緩衝液(5x)を調製します:500 mM HEPES、500 mMスクロース、275 mM酢酸ナトリウム、200 mM酢酸カリウム、50 mMグルコース、6 mM塩化マグネシウム、および5 mM塩化カルシウム。10 N 11:8水酸化ナトリウム:水酸化カリウムを使用して、pHを7.4にします。ろ過により滅菌します。オートクレーブはしないでください。-20°Cで保存し、必要に応じて解凍して、卵子調製ごとに1x Robb'sを~200 mL調製します。
- 固定ソリューション。
- オプション#1:ホルムアルデヒド/ヘプタン固定を準備します。固定バッファーを調製する:1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と150 mMスクロース。使用するには、卵子調製あたり687.5 μlのFixation Bufferと312.5 μlの16%ホルムアルデヒドで新鮮に調製します><。
注意：ドラフト内でホルムアルデヒド溶液を使用するときは手袋を着用してください。廃棄物は機関のガイドラインに従って処分してください。
- オプション#2:ホルムアルデヒド/カコジル酸固定を準備します。250 mMスクロース、100 mM酢酸カリウム(pH 7.5)、25 mM酢酸ナトリウム(pH 7.0)、および25 mM EGTA(pH 8.0)の固定ミックスを調製します。使用するには、卵子調製あたり400 μl Fix Mix、100 μLカコジル酸カリウム (1 M、pH 7.2)、および500 μl 16% ホルムアルデヒドで新鮮に調製します
注意：カコジル酸カリウムにはヒ素が含まれています。
- PBS/Triton X-100を調製する:1x PBSと1%または0.05%のTriton X-100。4°Cで保存してください。
- PBS-Tween 20-ウシ血清アルブミン(BSA)(PTB)を調製します:1x PBS、0.5%BSA(w / v)、および0.1%Tween-20。4°Cで1週間保存できます。
2. 後期ショウジョウバエ卵子の採取
- メンブレンがそのままのショウジョウバエ卵子はプラスチックやガラスに付着するため、卵子調製ごとに5 mlチューブ1本とパスツールピペット1本の内側をPTBでプレコートします。
- ~100~300匹の酵母フライすべてを二酸化炭素で麻酔し、~100mlの1x Robb's Bufferを含むブレンダーに加えます。3回(各~1秒)パルスします。活性化を避けるために、卵子をロブスに<20分間置いてください.
注:あるいは、卵子を女性から手で解剖することもできます。この方法の利点は、必要な女性が少ないことです。ただし、低酸素症に関連するアーティファクトを避けるために、二酸化炭素への曝露を数分に制限するように注意する必要があります。
- 大きなメッシュ(~1,500μm)を250mlのビーカーに通してろ過し、大きな体の部分を取り除きます。メッシュ上に無傷の腹部が多数残っている場合は、追加のロブバッファーを使用して材料を再研磨し、再度フィルタリングします。~2分ほど落ち着かせた後、最上層から吸引し、体の大きな部分をできるだけ多く取り除きます。
- 小さなメッシュ(~300μm)を通して250mlのビーカーにろ過します。追加のロブピペットとコーティングされたパスツールピペットを使用して、最初のビーカーから残りの卵子を洗い流します。~3分で落ち着かせてください。卵子は落ち着きます。~10 ml 以外はすべて吸引します。
- コーティングされた5mlチューブに収まるだけ10mlを注ぎます。落ち着かせ、液体を取り除き、残りで繰り返します。追加のロブピペットとコーティングされたパスツールピペットを使用して、ビーカーから残りの卵子を洗い流します。5mlのチューブに3~5分間入れます。
3. 薬物治療(オプション)
- 卵子調製ごとに2本目の5 mLチューブにPTBを塗布し、卵子調製ごとにそれぞれ1 mLのRobb'sに適切な溶媒(コントロール)または薬剤を添加します(表1)。
- 卵子を2番目のコーティングされた5mlチューブに分割します。落ち着かせて液体を取り除き、1 mlのロブスプラス溶剤を1つのチューブに加え、1 mlのロブプラス薬を2番目のチューブに加えます。薬物治療のための適切な時間の間、ヌテートします(表1)。落ち着かせてください。
4. 固定
- すべての液体を吸引し、すぐに1mlのフィックスを追加します。
- オプション#1:ホルムアルデヒド/ヘプタン固定(固定バッファーと5%ホルムアルデヒド)。
- ニュータで2.5分間固定します。ヘプタン1mlを加え、1分間ボルテックスします。~1分ほどで落ち着かせてください。
- すべての液体を取り除き、1 ml 1x PBSを追加します。ボルテックス 30秒~1分ほどで落ち着かせてください。
- すべての液体を取り除き、チューブに1x PBS.
を充填します
注:卵子はすぐに使用するか、室温で数時間ニューテーターに保持することができます。
- オプション#2:ホルムアルデヒド/カコジル酸固定(Fix Mixと8%ホルムアルデヒドおよび100 mMカコジル酸)。
- ニューテーターで6分間固定します。2分落ち着かせてください。液体を取り除き、チューブに1x PBS.
を充填します
注:卵子はすぐに使用するか、室温で数時間ニューテーターに保持することができます。
5. 膜の除去(「ローリング」)
- コーティングされたパスツールピペットを使用して、スライドガラスのつや消し(サンドブラスト)部分に~500〜1,000個の卵子を加えます。鉗子を使用して、すべての体の部分と無関係な材料を取り除きます。卵子を乾燥させないでください。必要に応じて1xPBSを追加します。
- 卵子の上にカバーガラスを置き、すべての膜が剥がれるまで卵子を優しく「転がす」ようにします(カバーガラスの端を卵子全体にドラッグするのが最適です)。顕微鏡下で定期的に進行状況を確認し、必要に応じて1x PBSを追加します。圧力がかかりすぎると卵子が破壊されるので注意してください。