$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Perkins and Bickel, Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。
1. コリオンとビテリン膜の除去
注: 必要なツールについては、図 1 を参照してください。
- 後期卵子の分離
- 1 mLのPBSBTxを浅い解剖皿に加えます。BSAコーティングされた先端を備えたP200を使用して、固定卵巣(~150μL)を浅い皿に移します。BSAコーティングされたピペットチップで卵巣を上下にピペットで動かし、成熟した卵子を成熟していない卵子から取り除きます。
- 後期卵子が十分に分離されたら、すべての組織を500 μLのマイクロチューブに移します。引っ張ったパスツールピペットで余分な液体を取り除き、チューブ内に約150〜200μLを残します。残りの遺伝子型についてセクション1.1を繰り返します。
- ローリングの準備
- 200 μLのPBSBTxで深いウェルディッシュを事前に濡らします。すりガラスのスライドを3枚用意し、スライド#3を脇に置きます。スライド#1と#2のすりガラス領域をそっとこすります。脱イオン水ですすいでガラスの破片を取り除き、使い捨てワイプで乾かします。
- スライド#1と#2のつや消し領域をPBSBTxでコーティングするには、1つのスライドに50μLのPBSBTxを加え、この領域をもう1つのスライドでこすります。使い捨てワイプで液体を取り除きます。
- スライドを図2Aに示す構成で解剖顕微鏡の下に置きます。スライド#1とスライド#2のつや消し領域を接触させ、スライド#3がスライド#2を支えます。
- 卵子を転がします。転がす方向が常に直線で、円運動をしないようにします。
- P200ピペットチップをPBSBTxで予湿し、ピペッティングで上下させて卵子をマイクロチューブに分散させます。卵子を含む液体50μLをスライド#1のすりガラス部分の中央に移します。これを行うには、スライド#2を持ち上げます。
- 液体の表面張力が2つのすりガラス領域の間にシールを作成するまで、スライド#2をゆっくりと下げます。曇りの領域を覆うのに十分な液体があるはずですが、染み出しているものはありません。液体があふれている場合は、引っ張ったパスツールピペットを使用して余分な液体を取り除きます。
- 片手で下部スライド(#1)を所定の位置に保持し、もう一方の手で上部スライド(#2)を水平方向に前後に動かし、スライド#2を水平に保ち、スライド#3で支えます。卵子の動きと進行状況を簡単に視覚化するために顕微鏡で行います.
注:この動きは摩擦を引き起こし、卵母細胞が「転がり」、絨毛膜を失います。最小限の圧力を使用し、動きは短くて速い必要があります。
- 水平方向に数回移動した後、移動角度を少し変えます (図 2B)。上側のスライドの動きが開始方向に垂直になるまで、この角度を徐々に90°まで徐々に増やします(図2B)。空の絨毛膜は液体中に見え、絨毛膜が不足している卵子はより長く、より薄く見えることに注意してください。
- 手順1.3.3〜1.3.4を約7〜10回繰り返して、溶液がわずかに曇るまで繰り返します。卵母細胞の大部分(75〜85%)がビテリン膜を失ったように見えるとき、ローリングを停止します.
注:独特の尖った端は、ビテリン膜を欠いている卵母細胞によく見られます。ビテリン膜は、絨毛膜よりも除去が困難です。ローリング中にトップスライド(スライド#2)に軽い圧力を加えると、ビテリン膜の除去が可能になります。すべての卵子からビテリン膜を取り除こうとすると、他の卵子が破壊されることがよくあります。
- 上部スライド(#2)をそっと持ち上げ、その角の1つを下部スライド(#1)のつや消し領域の中心にドラッグして、転がされた卵子がつや消し領域の中心に蓄積するようにします。両方のスライドの卵子をPBSBTxで洗い流し、PBSBTxを含むディープウェルディッシュに入れます。
- スライド#1と#2を超純水で洗浄し、使い捨てワイプで乾かし、リセットします。同じ遺伝子型のすべての卵子がロールされるまで、手順1.3.1〜1.3.6を繰り返します。これには通常、遺伝子型ごとに3〜4ラウンドのローリングが必要です。
- 転がした後の破片を取り除く
- 1 mL PBSBTx を 15 mL コニカルチューブに加えます。液体を渦巻いてチューブの側面をコーティングします。
- PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して、転がされた卵子をディープウェルディッシュから1 mLのPBSBTxが入ったコニカルチューブに移します。さらに2 mLのPBSBTxを卵子が入ったコニカルチューブに追加します。
- 卵母細胞が底に落ち着き始めるのを待ってから、破片(絨毛膜、ビテリンなど)を含む溶液の上部2mLをP1000で取り出して廃棄します。.必要に応じて、円錐形のチューブを暗い背景に当てて、不透明な卵子が沈むのを確認します。
- さらに2 mLのPBSBTxを卵母細胞に加え、ステップ1.4.3を繰り返します。1.4.3を繰り返します。合計3ラウンドの破片除去。
- PBSBTxコーティングされたP1000ピペットチップを使用して、卵子を元の500 μLマイクロチューブに戻します。20〜25人の女性から約50 μLの転がされた成熟卵子が得られます。
- 残りの遺伝子型について、新鮮なつや消しスライド、清潔な深い井戸皿、および各遺伝子型の新しい円錐形チューブを使用して、セクション4を繰り返します。
- 保存が必要な場合は、卵子を0.1% TritionX-100で1x PBSに移し、4°Cで一晩保存してください。ホルムアルデヒド架橋は非イオン性界面活性剤によって逆転する可能性があるため、長期保存はお勧めしません。
