キューティクルの混乱:ショウジョウバエの幼虫から血リンパを採取する方法

要約

出典:Reimels、TAおよびPfleger、CMショウジョウバエの幼虫のリンパ腺と血球を調べる方法。J. Vis. Exp.(2016年)。

ショウジョウバエの血リンパは、血液と間質液の両方として機能し、幼虫と成虫の段階で全身を循環します。このビデオでは、循環細胞を定量するために幼虫の血リンパを採取するプロトコルについて説明しています。

プロトコル

このプロトコルは、Reimels and Pfleger, Methods to Examining the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2016年)。

1. 循環血球濃度

1. このアッセイでほぼ同じ発育段階の幼虫を得るには、雌が2〜6時間の一定期間産卵できるようにして、採卵を制限します。
2. 1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた解剖皿ウェルで幼虫を収集します。
3. 幼虫1匹につき、氷上の微量遠心チューブに1x PBS10 μlを、清潔な解剖パッドに1x PBS10 μlを入れます。解剖パッドを照明付きの実体顕微鏡ベースに置きます。
4. 個々の幼虫をティッシュワイプの上に置いて乾燥させ、解剖パッド上のPBSドロップに移します。
5. 一対の鉗子を使用して、キューティクルをそっと引き裂き、慎重に反転させて血リンパを放出します.
   注:キューティクルをこすったり、突き刺したりしないように注意してください。
6. ピペットを使用して、解剖パッドから血リンパを採取します。脂肪体などの幼虫の破片を集めないでください。
7. 微量遠心チューブに血リンパ液を加え、ピペッティングで上下に混合します.
   注:一度に複数のサンプルを採取し、最大1時間氷上に保管することができます。
8. オプション:トリパンブルーと血リンパサンプルを等量ずつ混合して、死んだ細胞を染色して除外します。トリパンブルーは細胞に有毒であるため、トリパンブルーを追加してから3分以内に細胞を数えます。
9. ピペッティングで上下に動かしてサンプルを混合し、10 μlを血球計算盤チャンバーにロードします。
10. 自動セルカウンターを使用する場合は、セルサイズと真円度に適切なパラメータを設定します。たとえば、最小セルサイズを2μm、最大セルサイズを22μm、真円度を75〜80%に設定して、正常な丸い血球を検出します。さまざまなパラメータを試して、ラメロサイトなどの大きくて紡錘形の血球を検出します。または、血球計算盤を使用して手動で血球をカウントします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
PBSタブレット	MPバイオメディカル	2810305
皿を解剖する	コーニング	7220-85
マイクロ遠心チューブ	デンビル	C2170
Sylgard 184キットから作られたシリコン解剖パッド	クレイデン(フィッシャーを通じて配布)	NC9644388(フィッシャーカタログ番号)	シルガードエラストマーキットの成分をメーカーの指示に従って混合することにより、シャーレで作られています。
実体顕微鏡	Morrell Instruments(ニコンディストリビューター)	MNA42000、MMA36300	ニコンモデルSMZ1000およびSMZ645
ティッシュワイプ	VWRの	82003-820
鉗子	電子顕微鏡科学	72700-DZの
P200ピペット	エッペンドルフ	3120000054
Countess自動セルカウンター	インビトゲン	C10227
Countess細胞計数チャンバースライド	インビトゲン	C10283
血球計算盤	ハウサーサイエンティフィック	3200
トリパンブルーステイン	ライフテクノロジー	T10282

円