ハエの蛹からの眼脳複合体の解剖:網膜組織を分離する方法

要約

出典:DeAngelis、MW、Johnson、RI 免疫組織化学、ウェスタン分析、およびRNA単離のためのショウジョウバエ蛹の網膜の解剖。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、ショウジョウバエの蛹から眼と脳の複合体を解剖し、分離する方法を説明しています。この注目のプロトコールは、例えば免疫染色や他の遺伝子発現実験と適合性のある高品質の組織を作製する手順を示しています。

プロトコル

このプロトコールは、DeAngelis and Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

1. 組織の準備

1. ショウジョウバエの交配(Greenspan、Cold Spring Harbor Laboratory Press、(2004)で前述したように)または培養特異的なショウジョウバエ株を設定して、目的の遺伝子型の蛹を取得します。多数の蛹が偶然に出現するように、これらのハエ培養物を栄養豊富な食品培地または酵母ペーストをたっぷりと添加した標準的な食品培地で重複して確立します。
2. ショウジョウバエの培養物を25°Cに維持します。UAS-GAL4システムを利用した交配の場合、GMR-GAL4は、形態形成溝の後方および蛹の発達全体にわたる幼虫の眼椎間板細胞で発現する理想的なドライバーです。クロスUAS-lacZ X GMR-GAL4は、非内因性で不活性なβ-ガラクトシダーゼタンパク質の発現を促進するため、理想的なコントロールクロスとして機能します。
3. 蒸留水で濡らした6インチの竹製スプリントの先端を使用して、健康な培養バイアル(図1B)を健康な培養バイアル(図1A)から静かに持ち上げ、1.5 mLの微量遠心チューブ(図1C)に入れます。
4. チューブをプラスチック製のピペットチップボックスに入れ、蒸留水に浸した小さなティッシュピースと一緒にチャンバーを維持し、蛹を乾燥から保護するのに十分な湿度を維持します(図1D)。解剖するまで蛹を25°Cでインキュベートします。
5. 乾いた6インチの竹製スプリントを使用して、蛹をマイクロ遠心チューブから黒い解剖皿にそっと押し出します。蛹から離れた解剖皿に新しい両面テープを置きます。
6. 一対の鉗子を使用して、蛹の背側を上にして(つまり、上向きの蓋、図1B)をテープ(図2 A)に慎重に置きます。蛹がテープにしっかりと付着していることを確認します。
   注:蛹ケースの水分はテープへの確実な接着を阻害しますので、その場合は、蛹を風乾させてから両面テープに貼り付けてください。

2. 眼脳複合体の解剖

1. 鉗子を使用して、各蛹の蓋を取り除きます(図2C)。
2. マイクロダイセクションハサミを使用して、各蛹の蛹ケースをスライスまたは切り開きます。蛹ケースをフラップして開き、頭、胸部、および前腹部を露出させ、蛹ケースの端を両面テープ(図2C)に固定します。
   注:蛹を完全に明らかにする必要はありません。
3. 鋭い鉗子で各蛹の腹部を突き刺して動物をつかみ、蛹のケースから取り出します(図2C)。
4. 蛹をテープから離して黒い解剖皿に置き、約400μLの氷冷リン酸緩衝液(PBS、pH 7.4)で覆います。
5. 鉗子で腹部をつかみ、マイクロダイセクションハサミで、胸部全体をきれいに断面に切り込み、蛹を半分に切ります(図2D)。
6. 各死骸の後部の残骸をPBSから取り除き、解剖皿の片側に置きます(廃棄しないでください、手順3.2.1を参照)。
7. 2対の細い鉗子を使用して、各蛹の胸部と頭を開き、眼と脳の複合体を明らかにします(図2E)。これを行うには、胸部上皮の切断端をつかみ、徐々に引き裂いて胸部を開き、次に頭部嚢を開き、眼脳複合体と周囲の脂肪組織を露出させます。
8. 組織をつかまずに、鉗子を使用して眼脳複合体を頭部嚢の残骸から遠ざけるか、引き裂かれて開いた頭部嚢から眼脳複合体をすくい取ります
   注:目と脳の複合体はダンベル型で、オフホワイトで、周囲のクリーム色の脂肪よりも半透明です (図 2B,E)。
9. 鉗子を使用して、目の組織に触れることなく、目と脳の複合体に関連するほとんどの脂肪を慎重に取り除きます。

3. 免疫蛍光のための組織処理

1. 説明に従って少なくとも6〜10個の蛹を解剖します(手順2.1〜2.9).
   注:各解剖の3〜4回の独立した反復は、仮説を検証するのに十分なデータをもたらす傾向があります。
2. 洗浄と固定
   1. P20またはP100ピペットチップの先端を清潔なカミソリの刃で切断して、先端の開口部を半径~1mmに拡大し、PBSと脂肪の混合物を上下にピペッティングして潤滑します。この脂肪は、ステップ2.6で除去した死体の残りから得ることができます。
   2. 眼-脳複合体を、氷上の9ウェルガラス皿中の~400μLのPBSに移します。潤滑チップとP20またはP100空気置換マイクロピペットを使用して、
      注:ピペッティング中に眼と脳の複合体が無潤滑のチップに付着し、損傷または失われます。
   3. PBSをピペッティングで上下させ、眼と脳の複合体を穏やかに渦巻かせることで、眼組織に関連する残りの脂肪を取り除きます。この洗浄手順とその後のすべての洗浄手順では、壊れやすい眼組織を損傷するため、眼と脳の複合体を直接上下にピペットで動かさないでください。
   4. 最小容量(<20μL)のPBS中の眼脳複合体を少なくとも250μLの固定剤に移します。溶液を上下にピペッティングして混合します。氷上で35分間インキュベートします.
      注:ステップ3.1.1で準備したのと同じ潤滑チップをこの転送に使用できます。
   5. 同じピペットチップで、眼と脳の複合体を~400 μLのPBSを含むウェルに移します。溶液をピペッティングで上下させて混合し、氷上で5〜10分間インキュベートして洗浄します。洗濯手順を少なくとも2回繰り返します。
      注:眼脳複合体は、ステップ3.3.1に進む前に、最終PBS洗浄、氷上、または4°Cで数時間維持できます。
3. 抗体染色
   1. 抗体溶液に曝露する前に組織をブロックするには、眼-脳複合体を~400 μLのPBTに移します。移し替えには、潤滑チップとP20またはP100空気置換マイクロピペットを使用します。氷上で10〜60分間インキュベートします。
   2. 一次抗体溶液を調製するには、適切な抗体をPBTで希釈します。眼-脳複合体は10μLアリコートの抗体溶液中でインキュベートされるため、調製される容量は10回の複製となります。
   3. 10 μLの抗体溶液を72ウェルマイクロウェルトレイのクリーンウェルに分注します。
   4. P10ピペットチップの先端を清潔なカミソリの刃で切断して、先端の開口部を半径~0.5mmに拡大し、PBTを上下にピペッティングして潤滑します。
   5. P10空気置換式マイクロピペットと潤滑チップを使用して、<3 μLのPBS容量の5つ以下の眼脳複合体を各10 μLの抗体溶液ウェルに移します。
   6. 抗体溶液をピペッティングして、抗体溶液をホモジナイズします。目と脳の複合体を上下にピペットで動かさないでください。
   7. 抗体溶液の蒸発を最小限に抑えるために、蒸留水に浸した小さな組織片をマイクロウェルトレイに入れ、トレイを密封します(蓋を設けるなど)。4°Cで一晩インキュベートします。
   8. マイクロウェルトレイから眼脳複合体を9ウェルガラス皿で~400μLのPBTに移し、洗浄します。P10空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用します(ステップ3.3.4の説明に従って準備します)。溶液を上下にピペッティングして混合します。氷上で5〜10分間インキュベートします。
   9. 洗濯手順を少なくとも2回繰り返します。P20またはP100空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用して、洗浄液間で眼脳複合体を移します。
   10. 必要に応じて、適切な蛍光色素でタグ付けされた二次抗体をPBTで希釈することにより、二次抗体溶液を調製します。6-10匹の蛹のバッチあたり100 μLの二次抗体溶液で十分です。二次抗体溶液を9ウェルガラス解剖皿に分注します。
   11. 眼脳複合体を二次抗体溶液に移します。移し替えには、P20またはP100空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用します。
   12. 眼-脳複合体を二次抗体溶液中で室温で1〜2時間、または4°Cで3〜5時間インキュベートします。光による蛍光色素の漂白を防ぐために、調製物をホイルで覆います.
       注:二次抗体溶液での最適なインキュベーション期間は、使用する一次抗体と二次抗体によって異なる場合があります。
   13. 眼脳複合体を9ウェルガラス皿で~400μLのPBTに移し、洗浄します。溶液を上下にピペッティングして混合します。氷上で5〜10分間インキュベートします。この洗浄ステップは少なくとも2回繰り返す必要があります。
4. 二次固定
   1. 二次固定の場合は、眼-脳複合体を少なくとも200 μLの固定液に移し、室温で20分間、または4°Cで35分間インキュベートします
      注:二次固定は眼組織を硬くし、取り付けを容易にします(ステップ3.5)。
   2. P20またはP100空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用して、9ウェルガラス皿の上で眼脳複合体を~400μLのPBTに移し、氷上で5分間洗浄します。
   3. 洗濯手順を少なくとも一度は繰り返します。
   4. P20またはP100空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用して、9ウェルガラス皿内の眼脳複合体を~400μLのPBSに移し、氷上で1〜2分間すすぎます。PBSをピペッティングして組織を動かし続けますが、組織を上下に動かさず、PBSリンス中に眼脳複合体が沈殿してガラス皿に付着するのを防ぎます。
5. マウンティング
   1. 眼-脳複合体を~200 μLの封入剤に移します。P20またはP100空気置換マイクロピペットとPBT潤滑チップを使用して、眼脳複合体を移植します。組織を封入剤中で1〜2時間平衡化させます。
   2. 5-8 μLの新鮮な封入剤を清潔な顕微鏡スライドに置きます。
   3. 清潔なカミソリの刃でP10チップをカットして先端の開口部を半径~0.5mmに増やし、これとP10空気置換マイクロピペットを使用して、5〜8μLの封入剤中の眼脳複合体をスライド上の封入剤の滴に移します。
   4. 2本のタングステン針を使用して、視葉から目を分離します。頑丈なタングステン針で眼脳複合体をスライドに固定し、細いタングステン針で各眼を関連する視葉から離します (図 2F)。
   5. 細いタングステン針を使用して、各眼の基底面をスライドに隣接させた状態で、各眼を顕微鏡スライドの表面に動かします。清潔なカバースリップをティッシュの上にそっと下ろし、マニキュアで固定します.
      注:スライド上に目を互いに近づけたり、一列に並べたりするように配置すると、その後の顕微鏡観察が容易になります。
   6. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して網膜を画像化します.
      注:スライドは、すぐに画像化しない場合は4°Cで保存する必要があります。

結果

図1:解剖のための蛹の選択と培養。(A)さまよう第3幼虫のインスター(L3)幼虫と蛹は、健康なショウジョウバエ培養の側面に沿って位置します。(B)蛹前は、保護蛹の場合に色素がまだ生成されていないため、半透明の白色で識別できます。蛹の前後軸と背腹軸は青色で示されています。湿らせた竹の添え木を使用して、バイアルの壁から蛹を取り外して摘み取ります。(C)蛹は、適切なラベル(遺伝子型、収集日、および収集時間)が付けられた1.5 mLの微量遠心チューブ内に入れられ、(D)空のピペットチップボックスから組み立てられた加湿チャンバー内で培養されます。湿らせたティッシュを箱の中に置くことで湿度を保ちます。

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント 竹のスプリント、6インチ テッド・ペラ・インク 116名 ブラックディスセッションディッシュ SYLG170またはSYLG184(細かく挽いた炭粉で黒く着色)で縁まで満たされたガラスシャーレ。室温で24〜48時間放置して重合します。 ブレードホルダー ファインサイエンスツール 10053 ウシ血清アルブミン シグマ・アルドリッチ A7906の 両面テープ 3メートル 665名 ショウジョウバエ&食品培地、栄養豊富な 7.5%スクロース、15%グルコース、2.5%寒天、20%ビール酵母、5%ペプトン、0.125%MgSO4.7H2O、0.125%CaCl2.2H20 ショウジョウバエ&食品培地、標準 ブルーミントンショウジョウバエストックセンターコーンミールレシピ.
(https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) 固定液 PBS中の4%フォルマデヒド、pH 7.4。 鉗子 ファインサイエンスツール 91150から20 鉗子は頻繁に研ぐ必要があります。 ホルムアルデヒド サーモサイエンティフィック 28908 ガラス9ウェル皿 コーニング 7220-85 9ウェルディッシュとも呼ばれています ガラスカバースリップ(22 x 22 mm) フィッシャーサイエンティフィック 12-542-B ガラス顕微鏡スライド(25 x 75 x 1 mm) フィッシャーサイエンティフィック 12-550-413 ガラスシャーレ コーニング 3160-100BOの グリセロール シグマ・アルドリッチ G5516 マイクロセントリグリーチューブ アクシゲン MCT-175-C マイクロダイセクションハサミ ファインサイエンスツール 15000から03 マイクロウェルトレイ(72 x 10 μLウェル) ヌンク 438733 封入剤 0.5%のN-プロピルガレートと80%のグリセロール(PBS) N-プロピルガレート シグマ・アルドリッチ P3130型 PBS(リン酸緩衝生理食塩水pH 7.4) シグマ・アルドリッチ P5368型 製造元の指示に従って準備します PBTの 0.15% TritonX および 0.5% ウシ血清アルブミン PBS、pH 7.4 ピンホルダー ファインサイエンスツール 26016-12 一次抗体:ヤギ抗GAPDH抗体 イムジェネックス IMG-3073の ウェスタンブロッティング用。1:3000で使用 一次抗体:ウサギ切断防止Dcp-1 細胞シグナル伝達 9578S 免疫蛍光染色用。1:100で使用 一次抗体:ラット抗DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク) DCAD2の 免疫蛍光染色用。1:20で使用 一次抗体:ラット抗DEcad DOI:10.1006 / dbio.1994.1287 DCAD1の タダシ・ウエムラからの贈り物。1:100で使用します。 メスの刃 ファインサイエンスツール 10050 スケープルブレードの小片を折って、ブレードホルダーに固定します。 二次抗体:488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) ジャクソン免疫研究 〒712-545-153 免疫蛍光染色用。1:200で使用 二次抗体:cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) ジャクソン免疫研究 111-165-144 免疫蛍光染色用。1:100で使用 二次抗体:HRP標識ヤギ抗ラットIgG(H + L) 細胞シグナル伝達技術 7077名 ウェスタンブロッティング用。1:3000で使用 二次抗体:HRP標識ウサギ抗ヤギIgG(H + L) ジャクソン免疫研究 〒305-035-003 ウェスタンブロッティング用。1:3000で使用 実体解剖顕微鏡(M60またはM80) ライカマイクロシステムズ または同様の顕微鏡 シルガード(ブラック) ダウコーニング SYLG170 シルガード(透明) ダウコーニング SYLG184 色は黒に細かく挽いたチャコールパウダー ティッシュ:キムワイプ キムテック 34120 トリトンX シグマ・アルドリッチ T8787 タングステン針、細かい ファインサイエンスツール 10130-10 ピンホルダーに挿入します タングステン針、頑丈 ファインサイエンスツール 10130-20 ピンホルダーに挿入します イーストペースト (地元のスーパーマーケット) 大さじ約 2 杯の Fleischmann's ActiveDry Yeast (または類似のもの) を ~20 mL の蒸留 H2O に溶解