ショウジョウバエ後期蛹間接飛行筋(IFM)解剖:ハイスループット組織収集の方法

要約

出典:花王、S.Y.、他Sketchion of Drosophila melanogaster オミクスアプローチのための飛行筋の解剖。J. Vis. Exp.(2019年)。

ショウジョウバエの飛行筋は、筋肉の発達と生理学のモデルシステムとして使用されます。このビデオでは、成体の飛行筋組織について説明し、蛹からのRNAシーケンシングに適した発達中の間接飛行筋を解剖するためのプロトコルに焦点を当てています。

プロトコル

このプロトコルは、Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。

1. 48時間APF後のIFM解剖

1. 2つの#5生物学グレードの鉗子、細かいはさみ、標準的なガラス顕微鏡スライド、ダブルスティックテープ、ピペット、ピペットチップ、ドライアイス、および(RNAアプリケーションの場合)単離試薬(材料の表を参照)を含む必要な機器を組み立てます。1x PBSチューブと微量遠心チューブを氷上で冷やします。
2. 軽く濡らした絵筆を使用して、段階的な蛹を顕微鏡スライドに取り付けた両面粘着テープのストリップに移します(図1A)。蛹を一列に並べ、同じ向き(腹側を下にしてスライドの底に向かって前方)に置きます
   注:絵筆やフィルターに水を使いすぎると、蛹がうまくくっつかないように注意してください。蛹がくっつかない場合は、まず乾いたフィルターまたはティッシュペーパーに移して乾かします。30分以内に解剖できる数の蛹をマウントします(理想的には~10匹の蛹)。
3. 蛹のケースから蛹を取り出します。鉗子を使用して、前気門の上の蛹のケースをからかい、開きます(図1B)。
4. 一対の鉗子を背側に向かってゆっくりとスライドさせ、鉗子が動くときに蛹のケースを切ります(図1B')。下にある蛹を破裂させないように注意してください。開いたケースから蛹を取り出し、すぐに2番目の顕微鏡スライド(図1 B"、C)上の1x PBSの滴に移します。
5. ライン内のすべての蛹に対して手順1.3と1.4を繰り返してから、両面テープスライドを脇に置きます。
6. 細いハサミを使用して、蛹の腹部を胸部から切り離し、別の山に押し込みます(図1D,D')。残りの蛹についても繰り返します.
   注:蛹の完全性が乱れたらすぐに、ステップ1.6で解剖の長さのタイミングを計り始めます。20〜30分でできるだけ多くのハエを解剖し、細胞死および関連するトランスクリプトームおよびプロテオミクスの変化を防ぎます。1 dの成虫または>90時間の蛹を解剖する場合、後の手順で細かいハサミで頭を追加で取り外すのが便利なことがよくあります。
7. ティッシュペーパーを使用して、1x PBS(通常は浮遊脂肪で曇っている)の大部分と腹部の山(図1E)を取り除きます。冷やした新鮮な1x PBSを残りの胸部に一滴加えます。
8. ハサミを使って胸部を半分に切ります(図1F,F')。頭から縦軸まで一気に切ります。または、ヘッドが取り外されている場合は、最初にヘッドが取り付けられた場所にハサミを挿入し、胸部の上部をIFMの間で縦方向に切ります。次に、胸部の腹側を同じ向きで2回目のカットで切ります。
9. すべての蛹を解剖するために手順1.7と1.8を繰り返し、スライドの中心近くに胸郭半切片の山を生成します。半切片が乾かないように、スライド上に十分な冷やした1x PBSがあることを確認してください.
   注:48時間APF後、IFMは、訓練された目で標準的な解剖顕微鏡で見えるほど大きくなります。プロトコルのこの時点で、蛍光標識のある筋肉を蛍光解剖スコープに移動して、IFMの同定やトレーニングの目的で行うことができますが、これは必須ではありません。
10. 胸部からIFMを解剖します。#5鉗子(図1 G、H)を使用して、半切片の1つを分離します。片方の鉗子の先端をIFMの中央の上下にそっと挿入します(図1G',H')。最初の鉗子を静止させたまま、細かいハサミを使用してIFMの一方の端をキューティクルと腱から切り離します。次に、IFMのもう一方の端をキューティクルから解放して切断します(図1G'',H'').
    注:最初のIFMカット後の胸部の向きによっては、胸部を180°回転させると、2回目のIFMカットが実行しやすくなると便利です。
11. 鉗子(図1G''',H''')で胸部からIFMバンドルを取り出し、PBSバブルの端に移して水の張力を使用して所定の位置に保持します(図1I)。カーカスをスライドの反対側に押します。残りの胸部半切片についても繰り返し、解剖されたIFMのコレクションを生成します.
    注:IFMがきちんとした山に留まらない場合は、ティッシュで1x PBSの一部を取り除きます。すべてのPBSが蒸発しないように注意し、解剖されたIFMと半胸部がバッファーで覆われたままになるようにしてください。
12. すべてのIFMを解剖した後、解剖した筋肉の品質管理を迅速に行います。#5 鉗子を使用して、サンプルに侵入した可能性のあるジャンプ筋またはキューティクルの断片をすべて取り除きます (Figure 1J-K'').
    注:跳躍筋はIFMとは違って見えます。Mef2-Gal4標識筋を蛍光下で解剖すると、ジャンプ筋は蛍光が弱く、形状や質感が異なります。通常の光の下では、ほぼ半透明に見えますが、IFM は不透明な乳白色です (図 1J-J'',K)。
13. 水張力を使用して、一対の鉗子(図1 L)の間で解剖されたIFMを捕捉します(ただし、押しつぶさないでください)。IFMを、250 μLの冷却した1x PBS(図1 M)をあらかじめ充填した1.5 mLの微量遠心チューブに移します。すぐにセクション 2.
    に進みます 注:鉗子の先端が互いに接近し、緩衝液から持ち上げられると、水の張力により、鉗子の先端の間に緩衝液の泡が捕捉されます。この気泡中にIFMも存在する場合は、溶液からIFMを持ち上げて、別のバッファー充填レセプタクルに簡単に移すことができます。鉗子を絞って先端を互いに触れないように近づけることが重要です、バッファーバブルに捕捉された組織が浸軟するのを防ぐため。

2. IFMサンプルをペレット化して保存する

1. 1.5 mLの微量遠心チューブを2,000 x gで3〜5分間遠心分離し、卓上型遠心分離機(図2A、B)でIFMをペレット
化します。
2. ピペットチップを使用してバッファーを取り出します(図2C)。
3. RNAアプリケーションの場合は、IFMペレットを目的のRNA分離バッファーの50〜100 μLに再懸濁します(材料の表、図2Dを参照)。それ以外の場合は、手順 2.4.
   に進みます 注:IFMは、質量分析調製または市販のキットによるRNAの単離のために、ステップ2.2の後に乾凍結することができます(代表的な結果を参照)。RNAアプリケーションの場合、IFMペレットを分離バッファー内で直ちに再懸濁および凍結することにより、より良い結果が得られます。
4. サンプルをドライアイスで凍結するか、液体窒素でスナップ凍結します(図2E)。下流の分析のためのサンプル調製の次のステップの準備ができるまで、-80°Cで保存してください.
   注:凍結保存後、サンプルは数ヶ月間保存してから、下流の調査のために処理することができます。

結果

図1:48時間APF後のIFMの解剖。(A)両面テープでの蛹の位置合わせ。(B)前方に開き、ケースを背側に切断し(B')、蛹を持ち上げることにより、蛹ケースから蛹を除去(B'')。円の記号は、図 2 と同じように表されています。(C)蛹の緩衝液への移動。(D)ハサミ(黄色の二重矢印)で切断し、胸部から分離することによる腹部の除去(D')。(E,F)クリーンバッファー(E)を添加し、次に胸軸を縦方向に半分に切断します(F、F')。(G,H...

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント 60 mm培養皿 シグマ・アルドリッチ Z643084-600EA グライナー皿、60 mm x 15 mM、通気式 携帯電話のカメラ、サムスンギャラクシーS9 サムスン SM-G960F/DS 顕微鏡で撮影していない写真に使用 両面テープ スコッチ/3M 3M ID 70005108587 両面テープ、ほとんどの事務用品取扱店で利用可能 デュモン #5 鉗子 ファインサイエンスツール 11252から20 イノックスストレートチップ11cm鉗子、バイオロジーグレード、0.05mm×0.02mmチップ 蛍光解剖顕微鏡カメラ、ライカDFC310 FXカメラ ライカ www.leica-microsystems.com 蛍光解剖顕微鏡ソフトウェア、Leica Application Suite(LAS)バージョン4.0.0 ライカ www.leica-microsystems.com 蛍光解剖顕微鏡 ライカ M165 FC ライカ www.leica-microsystems.com フライ:Bru1[M2] フライストック;この論文 フライ:Bru1[M3] フライストック;この論文 フライ:Mef2-GAL4 ブルーミントンストックセンター BDSC:27390 フライストック フライ:salm[1] ブルーミントンストックセンター 3274名 フライストック フライ:salm[FRT] ハエ株;Spletter et al., Elife, 2018を参照 フライ:UAS-Bru1IR ウィーンショウジョウバエ研究センター GD41568 フライストック、RNAiヘアピン フライ:UAS-GFP::GMA ブルーミントンストックセンター BDSC:31776 フライストック フライ:UAS-mCD8a::GFP ブルーミントンストックセンター BDSC:5130 フライストック フライ:w[1118] ブルーミントンストックセンター 3605 フライストック フライ:weeP26 ハエ株;Clyne et al., Genetics, 2003を参照 GFP検出試薬、GFP-Booster(GFPブースター) クロモテック GBA488-100 グリコーゲン インビトゲン 〒10814-010 画像処理ソフト Photoshop CS6 アドービ www.adobe.com イソプロパノール シグマ・アルドリッチ I9516-25ミリリットル 2-プロパノール 方法1(RNA単離):トリゾール ライフテクノロジー 15596018 イソチオシアネートグアニジニウムとフェノール単相溶液 方法2(RNA単離):方法1 + TURBO DNAフリーキット インビトゲン AM1907 TRIzol単離とそれに続くDNA除去キットによる治療 方法3(RNA単離):Direct-zol RNA Miniprep Plusキット ザイモリサーチ R2070Sの TRIzolでのRNA単離、ただし相分離を使用する代わりに市販のカラムで。
Monarch DNase I 反応バッファー中の Monarch DNase I を用いて行う推奨 DNase 処理。 方法4(RNA単離):RNeasy Plusミニキット キアゲン 74134 提供されたDNase処理を使用しました。IFMペレットは、動物組織に推奨されるようにRTLバッファーでホモジナイズしました。 方法5(RNA単離):ReliaPrep RNA組織ミニプレップシステム プロメガ Z6110 「Purification of RNA from Fibrous Tissues」のプロトコールを適用しました。 方法6(RNA単離):Monarch Total RNA Miniprep Kit ニューイングランドバイオラボ T2010Gの このプロトコールを組織/白血球に適用し、300 μLのRNA Protection Reagentで溶解しました。 マイクロ遠心チューブ サーモフィッシャー AM12400 RNaseフリーマイクロチューブ、1.5 mL 顕微鏡スライド サーモフィッシャー 12342108 標準スライド、帯電なし、1 mm 絵筆 マラブ 19100000000 Marabu Fino Round No. 0、または任意の画材からの同様のブラシ パラホルムアルデヒド シグマ・アルドリッチ 158127 PBSバッファ(1x) シグマ・アルドリッチ P4417型 1 L 溶液用リン酸緩衝生理食塩水錠剤、pH 7.4 PFA PureTip ピペットチップ エレメンタルサイエンティフィック ES-7000-0101 サンプル損失を低減するための標準的なピペットチップのオプションの代替品、100 mL、オリフィス 0.8 mm ピペットのヒント シグマ・アルドリッチ P5161型 ユニバーサル 200 mL ピペットチップ RNA concentration Approach 1 & RNA integrity traces, バイオアナライザー アジレント・テクノロジーズ G2939BA RNA濃縮アプローチ2、ナノドロップ サーモフィッシャー ND-2000 RNA 濃度 アプローチ 3、Qubit 4 蛍光光度計 インビトゲン 質問33238 RNアーゼA プロメガ A7937 RNaseフリー水、ジエチルピロカーボネート(DEPC) シグマ・アルドリッチ D5758 DEPCは水を一晩処理し、その後オートクレーブ処理して、すべてのRNaseを除去します。 RTキット#1:Super Script III逆転写酵素キット インビトゲン 18080-044 逆転写キット RTキット#2:ルナスクリプト ニューイングランドバイオラボ E3010Sの 逆転写キット RT キット #3:QuantiNova 逆転写キット キアゲン 205410 逆転写キット 統計ソフト:GraphPad Prism GraphPadプリズム www.graphpad.com 統計ソフト:Microscoft Excel マイクロソフト バンドルの一部として購入: Office Home & Student 2019 卓上遠心分離機 エッペンドルフ 5405000760 Eppendorf Centrifuge 5425 または同等品 ティッシュ/キムワイプ シグマ・アルドリッチ Z188956 標準的なティッシュペーパー トランスファーピペット シグマ・アルドリッチ Z350796 プラスチックピペット バンナスの春はさみ ファインサイエンスツール 15000-00 刃先3mm、先端径0.05mm、長さ8cm Whatmanのペーパー シグマ・アルドリッチ 1004-070 ろ紙サークル、グレード4、70 mm