ショウジョウバエ In Vivoカルシウムイメージング:神経活動の機能イメージング法

要約

出典:Hancock, C. E., et al. Drosophila melanogasterにおける学習誘発シナプス可塑性のIn Vivo光学カルシウムイメージング。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、GCaMPを使用したショウジョウバエニューロンのin vivoカルシウムイメージングについて説明しています。注目のプロトコルクリップは、嗅覚コンディショニング実験中にキノコ体ニューロンからのGCaMP蛍光の変化を記録する方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

1. in vivoカルシウムイメージング

1. 赤外線レーザーと水浸対物レンズ(材料の表を参照)を備えた多光子顕微鏡を振動遮断テーブルに設置して使用します。GFPベースのカルシウムインジケーターを可視化するには、レーザーを920nmの励起波長に調整し、GFPバンドパスフィルターを取り付けます。
2. 粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、関心のある脳の領域を特定します。クロップ機能を使用すると、この領域のみにスキャンを集中してスキャン時間を最小化し、頭の前方が下を向くようにスキャンビューを回転させることができます。
3. フレームサイズを512 x 512ピクセルに、スキャン速度を>4Hzに調整し、スキャン領域(Y次元)を調整して、目的のニューロンがカバーされるようにします。

2. 嗅覚コンディショニングによる臭気誘発カルシウム過渡現象の可視化

1. 複数の臭気刺激を時間的に正確に送達できる臭気送達システムを使用します。
   1. 追加のコンピューターを使用してデバイスを制御し、イメージング顕微鏡ソフトウェアと通信して、実験中の画像キャプチャと臭気刺激を調整します。
   2. 画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラム(例:顕微鏡制御ソフトウェアにインストールされたVBAマクロパッケージ、材料の表を参照)をリンクできる事前にプログラムされたマクロパッケージを開始します。これは、別のプログラムでの臭気送達プロトコルの開始によって提供される外部入力トリガーに応答します)。
2. 512 x 512 px の解像度と 4 Hz のフレーム レートで、"事前学習"/ナイーブな臭気誘発カルシウム過渡現象を監視して測定を開始します。臭気発生の 6.25 秒前 (F₀ ベースライン値を確立) と臭気オフセットの 12.5 秒後に追加の画像取得を挟んだ 2.5 秒の臭気刺激を提供します。これを2番目の臭気物質で繰り返し、次に3番目の臭気物質で繰り返します。
3. この測定の3分後、フライを古典的条件付け(「トレーニング」)して続けます。
   1. 「プレトレーニング」フェーズで提示された臭気の1つを選択してCS⁺の臭気にし、もう1つを選択してCS^-の臭気にします。コンピュータ制御の臭気配信システムを使用して、CS⁺の臭気を60秒間、12回の90V電気ショックとともに提示します。
   2. 60秒の休憩後、CS^-臭気を単独で60秒間提示し、4-メチルシクロヘキサノールと3-オクタノールを臭気物質として使用します。このトレーニング中に3番目の臭気物質(例:1-octen-3-ol)は、トレーニングフェーズの前（ステップ2.2)とトレーニングフェーズ））後）(ステップ2.4)のみコントロールとして使用されますので、ご提示しないでください。
4. トレーニングフェーズ(ステップ2.3)の終了から3分後に「トレーニング前」の臭気刺激プロトコル(ステップ2.2)を繰り返すことにより、「トレーニング後」の臭気誘発カルシウム過渡現象を再度測定します。
   注:このステップのタイミングは、記憶形成後の関心のある時間を反映する必要があります(たとえば、このステップを条件付けステップの3〜4分後に実行して、短期記憶を調査します)。通常、ハエはこの準備で数時間生き残ることができます。
5. イメージングファイルは、後で画像解析を行うために、適切な形式(Tiffなど)で保存します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-オクテン-3-オール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	O5284	匂い物質として使用される化学物質
3-オクタノール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	218405	匂い物質として使用される化学物質
4-メチルシクロヘキサノール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	153095	匂い物質として使用される化学物質
EGFP用バンドパスフィルター(525/50nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ
鉱油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	M8410	臭気物質の希釈剤として使用
モードロックTi-Sapphireレーザーカメレオンビジョン2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA (米国カリフォルニア州サンタクララ		チューナブル赤外線フェムト秒レーザー
BiG検出器を搭載した多光子顕微鏡LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ		多光子顕微鏡、複数の企業が同様のデバイスを提供しています。
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) 水浸対物レンズ	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ	421452-9900-000	対物レンズ W "プランアポクロマート" 20x/1.0 DIC M27 70mm
臭気伝達装置からトリガーを受け取るためのVBA(Visual Basics of Applicatons)ソフトウェアと、顕微鏡を制御するZeiss社のZENソフトウェアと相互作用する電撃応用装置(電源)	カスタムメイドで、ご要望に応じてご利用いただけます	N.A.	N.A.