$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Gervaise and Arur, Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2016年)。
1. 生殖腺を得るための成虫の解剖
- 1.5 mLの微量遠心チューブにM9バッファー100 μLで、所望の特異的な発生段階(L1、L2、L3、L4、成体など)の線虫の100 - 150 WT(N2)または所望の遺伝子型を選びます。
- 微量遠心チューブに900μLのM9バッファーを満たします(材料表を参照)。チューブを1,000 x gのマイクロ遠心分離機で1分間、周囲温度で遠心分離します。
- 900μLのM9バッファーを静かに取り出し、廃棄します。解剖顕微鏡でバッファーを取り外して、ワームが誤って除去されないようにします。
- 手順 1.2 から 1.3 を、毎回新しい M9 バッファーでさらに 2 回繰り返します。これにより、ワームと一緒に持ち越された細菌が効果的に洗い流されます。
- 最終洗浄後、900μLのM9バッファーをチューブから取り出して廃棄します。
- 残りの100 μLのM9バッファー100 μLを、100 - 150 Wormsと200 μLマイクロピペットチップを平底ガラス製ウォッチディッシュに移します。使用前に、マイクロピペットの先端が10μLのマークでカットされていることを確認してください。先端を切らないと、ワームが剪断されます。
- 1 - 3 μL の 0.1 M レバミゾールを、M9 バッファー中のワームを含むガラス製ウォッチディッシュに加えます。レバミゾールとM9を静かに渦巻かせて、ワームの動きが止まるまで均一に混合できるようにします。
注:レバミゾールストックは、長期保存のために-20°Cで保存できます。ここでは、動物の運動性の急速な損失を得るために、0.2〜0.25 mMのレバミゾールの文献23に記載されているものよりも高い濃度の1〜3 mMを使用します。動物が液体懸濁液中で長時間飛び回ると、生殖腺で生じるdpERKのパターンは変動する可能性があります(ストレスまたは栄養不足、またはその両方が原因です)。より再現性の高い染色パターンは、解剖用の1〜3 mMレバミゾールで達成されています。
- 2本の25G針を2本の1mLシリンジに取り付けます(シリンジのサイズは関係なく、針のゲージが重要です)。各手に1本のシリンジを置きます(図1)。
- 解剖顕微鏡下で、図1に示すように各針を各線虫の下および上に配置し、はさみのような動きで2番目の咽頭球の近くの線虫に細かい切り込みを置きます。ワームを1回切った後、皿内のすべての動物が少なくとも1回は切り取られるまで、次の動物に移ります
注: ステップ 1.8 から 1.9 は時間的制約があることに注意してください。ディッシュ内のすべてのワームを5分以内に解剖し、再現性のあるdpERKパターンを採取します。解剖時間が長くなると、特にゾーン1ではdpERK信号がオフになります。必要に応じて、解剖ラウンドあたりのワームの数を調整します(つまり、50匹対150匹)。
- 解剖中に押し出された生殖腺が見えない場合は、同じ動物で別のカットを試みないでください。.通常、それは動物を剪断するだけで、生殖腺の押し出しにはつながりません。代わりに、次の動物に移ります。生殖腺が押し出されないワームは、セクション6で作成されるスライドにそのように表示され、イメージング中
注: すべての解剖および処理ステップを通じて、生殖腺が体/死体に付着したままであることを覚えておくことが重要です。針で生殖腺と体を無理に引き離さないでください。多くの場合、生殖腺を体から切断しようとして性腺組織に異常な裂傷があると、偽の抗体シグナルが発生する可能性があります。イメージングステップでは、体/死体は無視でき、生殖腺のみがイメージングされます。さらに、腸内細胞がアッセイ対象の抗体の内部コントロール/体細胞コントロールとしても機能することもあります。
図1:解剖中の針の位置のデモンストレーション。 左:解剖中の写真。右:ワームを基準にした針の位置。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
