シングルワームPCR:ゲノムDNAを抽出し増幅する方法

要約

出典:Prior, H., et al.CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質を用いてC.エレガンスにおけるゲノムポイント変異体を生成するための迅速で簡便なパイプライン。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、PCRスクリーニングにより、単一の線虫の遺伝子マーカーを迅速にスクリーニングする手法について説明しています。このプロトコル例では、CRISPRベースのゲノム編集をスクリーニングします。

プロトコル

以下のプロトコルは、Prior et al, A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

シングルワームPCRとジェノタイピング

1. 産卵の1〜2日後、ワームピックを使用して、7 μLのWorm Lysis Bufferを含む個々のPCRストリップチューブキャップにF₁sを移します(表1、図1D、4〜5日目)。
2. PCRチューブを室温で最高速度1分間遠心分離して動物をチューブ底に運び、チューブを-80°Cで1時間凍結します
   注:ワームは-80°Cで無期限に保存できます。
3. 次のプログラムを使用して、サーモサイクラーで凍結したワームを溶解します:60°Cで60分間、95°Cで15分間、4°Cホールド。
4. 表2に示すようにPCRマスターミックスをセットアップします。
5. 21 μLのPCRマスターミックスを清潔なPCRチューブに加え、ステップ3の4 μLのワーム溶解液を加えます。ピペットを使用してよく混合し、メーカーのガイドラインに従ってPCRプログラムを実行します(材料表を参照)。
6. DNA Clean and Concentrateキットを使用して、製造元の指示に従ってPCR反応を精製します(材料表を参照)。スピンカラムに10 μLの水を加えてDNAを溶出します。
7. 表3に示すような制限酵素マスターミックスのセットアップ。
8. 各洗浄したPCR反応液に10 μLの制限酵素マスターミックスを加え、37°Cで1〜2時間インキュベー
トします。
9. 1x Tris-acetate-EDTA(TAE)バッファーを使用して、120 Vで泳動する1.5%アガロースゲル上で消化済みPCR産物を分離します。

結果

図 1.CRISPR-Cas9 engineering of the C. eleganssod-1遺伝子座 (A) C. elegansにおけるsod-1遺伝子座のエクソンイントロン構造を描いた模式図。赤いバーは、エクソン3のG93の位置を示しています。プライマーペアセットは、赤い矢印(F1-R1)で示されています。(B)ヒトとC.エレガンス(線虫)SOD-1タンパク質の配列アラインメント。対象となるG93残基は赤で強調表示されています。(C)上は、G93コドンを取り囲むゲノムDNAのセクションを参照として示し、PAM(緑)およびsgRNA標的(...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヌクレアーゼフリーの水	株式会社シンテゴ	sgRNAキットEZキットに付属
KCl	シグマ	P5405
DNA Clean & Concentrator	ザイモリサーチ	D4004
ZymocleanゲルDNAリカバリーキット	ザイモリサーチ	D4002
Q5ホットスタートハイファイ2Xマスターミックス	ニューイングランドバイオラボ	M0494L
プロテイナーゼK	シグマ	P2308
MgCl2	シグマ	M2393
NP-40	シグマ	74385
トゥイーン-20	フィッシャーサイエンティフィック	BP337-100
RNaseZap除染ソリューション	フィッシャーサイエンティフィック	AM9780

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