線虫のナイルレッド染色:固定動物の脂肪滴を可視化する方法

要約

出典:Escorcia, W., et al.ナイルレッドおよびオイルレッドO染色による線虫Caenorhabditis elegansの脂質存在量の定量化と脂質分布の評価。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、固定された線虫全体でNile Red色素を使用して脂質を染色するプロトコルについて説明しています。脂質液滴のコアにある中性脂質を具体的に見るには、染色されたC.エレガンスの緑色の発光スペクトルを画像化します。

プロトコル

このプロトコルは、Escorcia et al, Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

1. 脂質のナイルレッド(NR)染色

1. 5 mg/mL NR原液の調製
   1. 500 mLのボトルに、100 mLのNR粉末を200 mLの100%アセトンに加えます。.
   2. 光が当たらないように、ボトルをアルミホイルで覆います。
   3. 使用する前に、溶液を暗闇で2時間攪拌します。
   4. 長期間使用する場合は、NRストック溶液を光にさらさないように密閉されたボトルに保管してください。研究ニーズに応じてNRストックソリューションをスケールアップします。NR染色実験全体で同じストック溶液を使用し、一貫した染色およびイメージング結果が得られるようにしてください。
2. NRワーキングソリューションの調製
   1. 40%イソプロパノール(v/v)1 mLごとに、NRストック溶液6 μLを添加します。
   2. 各サンプルに600μLのNRワーキング溶液を調製します.
      注:染色直前に新鮮なNRワーキングソリューションを作成します。NRストック溶液のニーズに応じて、15 mLまたは50 mLの目盛り付きコニカルチューブを使用します。
3. NR脂質染色のための線虫の調製
   1. 後期ログOP50大腸菌を播種した線虫増殖培地(NGM)で、20°Cでワームを早期L4段階まで成長させます。
   2. 1 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水+ 0.01% Triton X-100(PBST)溶液でプレートからワームを洗い流し、ワーム懸濁液を1.5 mLのマイクロフュージチューブに入れます。
   3. 線虫を560 x gで1分間遠心分離し、上清を取り除き、大腸菌が懸濁液から除去されるまでこの手順を繰り返します。
   4. 40%イソプロパノール100 μLをワームペレットに加え、室温で3分間インキュベー
   トします。
   5. ワームを560 x gで1分間遠心分離し、ワームペレットを乱さずに上清を取り除きます
      注:より大きなプレートを使用する場合、またはプレートごとにより多くのワームを染色する場合は、プレートからワームを洗い流すために、より多くのPBSTを使用します。サンプル固定の15分以上前にワームをPBSTで洗浄しないでください。上清からバクテリアが除去されていない場合は、追加の洗浄を行います。40%イソプロパノール中で、ニューテーターまたはロッカーを用いてインキュベーションを行う。常にチューブを監視して、サンプル全体の攪拌が発生していることを確認してください。
4. NRによる脂質染色
   1. 暗所で、各サンプルに600 μLのNRワーキング溶液を加えます。チューブを3回反転させ、NR溶液でウォームを完全に混合します。
   2. 暗所でサンプルを室温で2時間回転させます。
   3. インキュベーション後、線虫を560 x gで1分間遠心分離し、上清を除去します。
   4. 600 μLのPBSTを添加し、サンプルを暗所で30分間インキュベートして、余分なNR染色を除去します。
   5. サンプルを560 x gで1分間遠心分離し、約50 μLの上清を除くすべて
      注:NRインキュベーションは攪拌を必要としません。このステップでは、ワームの沈降が一般的です。
5. 顕微鏡イメージング用スライドの作製
   1. ワームペレットを残りの上清に再懸濁します。.
   2. 5 μLのウォーム懸濁液を顕微鏡スライドに置き、気泡が閉じ込められないように慎重にカバースリップを貼ります。
   3. ワームをイメージングする前に、カバースリップをマニキュアで密封します。
   4. 一度に数枚のスライドだけを準備します。これにより、NRイメージングがサンプル間で一定に保たれるようになります。NR染色された画像の品質は、6時間後に低下します。離散的な脂肪滴は観察が難しく、バックグラウンド蛍光が増加するため、NRシグナルの検出に支障をきたします。
6. NR染色された線虫のイメージング
   1. 5倍の倍率で線虫を画像化し、視野ごとに複数の動物を捉えます。
   2. 10倍の倍率に切り替えると、個々の線虫の定量が向上します。
   3. FITC/GFPチャンネルを使用してNR染色された線虫をイメージングし、さまざまな露光時間を試して定量に最適な条件を決定します。
   4. 圧縮によるデータの損失を避けるために、ファイルをTIF形式で保存します。.
      注:一般的な露光時間は100〜1000ミリ秒の範囲です。最適な露光時間を確保し、イメージングの一貫性を維持するために、すべてのサンプルにそれを使用します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Imager.M2m 顕微鏡	ツァイス	該当なし	蛍光顕微鏡
ERC5sカメラ	アクシオカム	該当なし	カラー対応
MRmカメラ	アクシオカム	該当なし	蛍光対応
ナイルレッド	サーモフィッシャー	N1142	脂質染色
イソプロピルアルコール	BDHの	BDH1133-1LP	固定液
遠心分離機5430	エッペンドルフ	5428000015	遠心機
チューブローテーター	VWRの	10136-084	回転子