出典:Clarke, E. K., et al. Caenorhabditis elegansにおける倍数性の操作。J. Vis. Exp.(2018年)。
ここでは、固定された無傷の線虫のゲノムDNAを視覚化するために使用される技術について説明します。このビデオには、未受精のC.エレガンス卵子のクロマチンをカウントするプロトコルの例が含まれています。
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方法論記事
エタノール固定とDAPI染色:C.エレガンスのDNAを可視化する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
このプロトコルは、Clarke et al, Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018) からの抜粋です。
四倍体株は、未受精卵子の染色体数を数えることで検証できます。蛍光顕微鏡法は、菌株が染色体の蛍光マーカーを持っている場合、未受精の二倍体卵母細胞(減数分裂の前)の染色体対の数をスクリーニングするために使用できます。蛍光染色体マーカーがない場合、四倍体線虫は、線虫を固定し、DNA色素で染色することによりスクリーニングできます。エタノール固定および全動物4′,6-ジアミジン-2′-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)染色のためのプロトコルについては、以下を参照してください。
全動物DAPI染色
注:12の連結染色体ペアを持つ四倍体株は、これらの動物をDAPI染色し、未受精卵子のDAPI体の数を数えることで検証できます。
- 顕微鏡スライド上に5〜10μLのM9バッファーを置き、6〜10個の線虫を液滴に移します。
- 解剖顕微鏡下で、糸くずの出ない洗浄ティッシュで線虫を除去せずに、液滴からM9の大部分を引き出します。次に、すぐに10μLの90%エタノールを線虫に加えます。ワームを完全に乾かしますが、数秒以内にしてください。
- エタノールが蒸発したらすぐに(これは解剖顕微鏡で起こるように見ることができます)、さらに10μLの90%エタノールを線虫に加えます。
- 手順3.1.3をさらに3回繰り返します。
- エタノールの最後の一滴が蒸発したら、選択した封入剤に推奨最終濃度で6 μLのDAPIまたはHoechst色素を加えます(たとえば、M9の2 ng/μLのDAPIストック濃度を1:1,000に希釈)。スライドの長期保存には、M9のみではなく、20 mM Tris-HCl、pH 8.8に溶解した0.5%p-フェニレンジアミンを90%グリセロールに溶解した退色防止剤として使用できます。
- スライド上のワームをカバースリップで覆い、カバースリップの端をマニキュアで密封します。カバースリップを追加してから少なくとも10分後に蛍光顕微鏡(ステップ3.1.7)でスコアを付けます。退色防止剤のないスライドは、スコアリング前に4°Cで数日間保存できますが、数日後に蛍光の品質が低下し始めます。
- 100倍の倍率で蛍光顕微鏡を使用して、精子のすぐ隣接し、まだ精子または子宮に入っていない最も成熟した未受精卵子の単一のDAPI体(おそらく単一の染色体ペア)の数をスコアリングします。
- 卵子核内の個々のDAPI体をスコアリングするには、顕微鏡のファインフォーカスを使用して、カウント中に卵子核の上部から下部にゆっくりと移動します。次に、焦点を反対方向(つまり、核の下から上)に動かしながら同じ核をカウントし直し、カウントされたDAPI体の数を確認します。
- 安定したLon系統ごとに少なくとも10個の雌雄同体で、2つの生殖腺のそれぞれで最も成熟した未受精卵子をスコアリングします。野生型卵子は、平均して6つのDAPI体、5つの常染色体ペア、および性染色体ペアを持っています。安定なLon系統の卵子に12個のDAPI体が存在することは、この系統の動物が部分四倍体(4セットの常染色体、3つのX染色体)または完全四倍体(4セットの常染色体、4つのX染色体)のいずれかであることを示しています。
- 菌株ごとに複数(少なくとも10)の卵子から観察されたDAPI体の平均数を計算します。一部の染色体ペアは互いに接触しているか、真上に重なっているため、卵子のDAPI体の数は実際の染色体ペアの数よりも少ないことがよくあります。
- (オプション)DAPI体の平均数が12である安定したLon株をさらに検証し、HTP-3などの染色体軸タンパク質に対する免疫蛍光染色により、それらが完全(4A、4X)または部分的(4A、3X)四倍体であるかどうかをテストします。この染色は、部分四倍体に存在する単一の未結合染色体から十字形パターンを示すことにより、染色体ペアを区別します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 解剖顕微鏡 | Motic Microscopy | SMZ171 | |
| >名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 染色 | |||
| Hoechst 33258, 五水和物 | ビオチウム | 40045 | |
| DAPI | ビオチウム | 40011 | |
| >名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| エタノール固定 | |||
| エタノール、純粋、190プルーフ(95%)、USP | コプテック、VWR | 89125-166 | |
| >名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| M9バッファ | |||
| 塩化ナトリウム、バイオテクノロジーグレード | VWRの | 97061-278 | |
| リン酸カリウム、一塩基性無水グレード | VWRの | 97062-346 | |
| リン酸ナトリウム、一塩基性二水和物 | フィッシャーサイエンティフィック | AC271750025 |
