遊泳誘発性麻痺(SWIP)アッセイ:C.エレガンスにおけるドーパミン媒介性運動を定量化する方法

要約

出典:Kudumala, S., et al.Caenorhabditis elegansにおけるドーパミンシグナル伝達を評価するための遊泳誘発性麻痺。 (2019年)。

ここでは、水泳のような激しい運動中に発生する C. elegans の行動表現型である SWIP を測定するアッセイを紹介します。このプロトコル例では、手動分析アプローチと自動分析アプローチの両方について説明します。

プロトコル

次のプロトコルは、Kudumala et al, Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

SWIP

注:AMPHで処理された野生型線虫のSWIPを手動で評価する方法について説明します。また、以前にHardawayらによって説明された自動ワームトラッカーと追跡ソフトウェアを使用したワームの追跡と、ワームの追跡とワームの動態のさらなる分析についても簡単に説明します。

1. SWIPを手動でテストする方法
   1. 200 mOsm/L スクロース溶液 40 μL を 0.5 mM AMPH の有無にかかわらず、ガラススポットプレートに分注します。ステレオスコープの下で、まつげまたはプラチナピックで8〜10個の後期L4ステージワームを選択し、ワームがピックから離れて溶液に泳ぐまで、溶液を含むプレートにピックを沈めます。ウェルに摘み取られたワームの数に注意し、タイマーを開始し、各分マークでSWIPを示すワームの数を観察して記録します。
   2. 生データをスプレッドシートにコピーし、毎分麻痺した線虫の数をアッセイ全体でテストした線虫の総数で割り、100を掛けて麻痺した線虫の割合を計算します。パーセント値を任意のグラフ作成および統計ソフトウェアにコピーし、XYグラフ形式を使用してY軸にパーセント値、X軸に時間でデータをプロットします。
   3. 二元配置ANOVAを実行し、その後に事後分析(ボンフェローニ事後検定など)を実行して、対照、AMPHグループ、および治療時間間の統計的有意性をテストします。
2. SWIPの自動分析
   1. 一度に 1 つのワームに対して自動解析を実行します。カメラをセットアップするためのプロトコル、ワームトラッカーソフトウェア、および追跡ソフトウェア分析を実行するためのスクリプトについては、Hardawayらで詳細に説明されています。
   2. 簡単に言うと、セクション1.1.2の手動方法で説明されているように、まつげピックを使用して、1つの後期L4ステージ雌雄同体をガラススポットプレートに配置します。一度に1つのワームの水泳ビデオを録画し、ワームトラッカーソフトウェアを使用して体の曲げの頻度を計算します。
   3. トラッキングソフトウェアに付属のスクリプトに従って、ワームスラッシングの頻度を取得し、ワームスラッシングデータからヒートマップを生成します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アンフェタミン	シグマ	51-63-8
くぼみガラススポットプレート	コーニング	コーニング株式会社 722085
まつげ
グラフ作成および統計ソフトウェア	プリズム		グラフパッド5
浸透計	アドバンスト・インスツルメンツ社	モデル3320
スプレッドシート	MSオフィス		マイクロソフトエクセル
実体顕微鏡	ツァイス	モデル tlb3. 1 ステミ2000
ショ糖	シグマ・アルドリッチ	RB=S5016
瞬間接着剤	ロックタイト	1647358.14オンス
SwimRソフトウェア	10.18129/B9.bioc.スイムR
トラッカー2	ワームトラッカー2.0	www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/
ビデオ録画ソフト	バーチャルダブ	http://www.virtualdub.org/