C. elegans摂食のためのRNAiプレーティング:大腸菌における標的dsRNA発現を誘導する技術

要約

出典:Kolundzic, E., et al.RNAiおよび熱ショック誘発転写因子発現のC.エレガンスにおける生殖細胞のニューロンへの再プログラムへの応用 J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、C.エレガンスにおけるRNAi処理の原理を説明し、トランスジェニック線虫株でlin-35をノックダウンするプロトコルを示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Kolundzic, et al, Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans, J. Vis. Exp. (2018)からの抜粋です。

1. 溶液調製
   1. NGM-寒天プレート(1 L)
      1. NaCl 3 g、ペプトン培地 2.5 g(バクトペプトンなど)、寒天 20 g を加えます。オートクレーブ後、コレステロール1 mL(95%EtOHストックに5 mg/mL)、1 M MgSO₄ 1 mL、1 M CaCl2 1 mL、1 M K2PO₄ 25 mL、およびアムホテリシンB(2.5 mg/mLストック
      )1 mLを添加します。
   2. NGM-寒天 RNAi プレート (1 L)
      1. NaCl 3 g、ペプトン培地 2.5 g、寒天 20 g を加えます。オートクレーブ後、コレステロール 1 mL(95% EtOH ストックに 5 mg/mL)、1 mL の 1 M MgSO₄、1 mL の 1 M CaCl2、25 mL の 1 M K₂PO₄、1 mL のアムホテリシン B(2.5 mg/mL ストック)、1 mL の 1 M IPTG、および 1 mL のカルベニシリン(50 mg/mL)を添加します。
   3. LB-寒天培地 (1 L)
      1. ペプトン培地10 g、酵母抽出物5 g、NaCl 5 g、寒天20 g、1 M Tris pH 8.0 10 mL を添加します。H₂Oを1 Lに加えます。オートクレーブ後、50 mg/mL カルベニシリン 1 mL と 5 mg/mL テトラサイクリン 2.5 mL を添加します。
   4. LBミディアム(1 L)
      1. ペプトン培地 10 g、酵母抽出物 5 g、NaCl 5 g、10 mL の 1 M Tris pH 8.0 を添加します。H₂Oを1 Lに加えます。オートクレーブ後、50 mg/mL カルベニシリン 1 mL を添加します。
   5. M9バッファー(1 L)
      1. Na₂HPO₄ 6.0 g、KH₂PO₄ 3 g、NaCl 5 g、ゼラチン 50 mg を添加します。使用前に、1 mLの1 M MgSO₄を加えてください。
   6. 漂白液(10mL)
      1. NaClO1 mLと5 N NaOH2 mLを添加します。H2Oを10mLに加えます。
2. RNAiプレートの調製
   注:C.エレガンスは通常、7.5 mLの線虫増殖培地寒天培地(NGM-寒天)を含む6 cmのペトリプレートで実験室で培養されます。このプロトコルは、15°Cに保存されたワームに最適化されています。NGMを使用したプレートを調製するには、真菌や細菌の汚染を防ぐために標準的な滅菌技術を使用します。以下は、RNAi用の試薬を添加したNGMプレートを調製するためのプロトコールです。
   1. 1 mM イソプロピル β-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG) と 50 μg/mL カルベニシリンを含む 6 cm NGM-寒天 RNAi プレートを準備します。それらを暗所12の室温で24〜48時間乾燥させます。
      1. RNAiプレートは暗所で4°Cに保ちます。14日以上経過した場合は使用しないでください。
   2. 50 μg/mL カルベニシリンと 12.5 μg/mL テトラサイクリンを含む LB 寒天プレート上の 3 相ストリーキングパターンを使用して、凍結グリセロールストックの凍結グリセロールストックから lin-53 遺伝子 DNA 配列を含む L4440 プラスミドを含む RNAi 細菌 (Escherichia coli HT115) クローンを選択します。バクテリアを37°Cで一晩増殖させます。このクローンは、細菌におけるlin-53 dsRNAのIPTG依存的な産生を可能にします。
      1. さらに、空のベクターコントロールとして、遺伝子配列を持たないL4440プラスミドを含むRNAi細菌を増殖させます。
   3. 翌日、200 μLのピペットチップを使用してlin-53または空のベクターLB寒天プレートから1つのコロニーを選び、それぞれを2 mLの液体LB培地と50 μg/mLのカルベニシリンを添加した別々の培養チューブに接種します。600 nmで0.6 – 0.8の光学密度(OD)に達するまで、37°Cで一晩培養します。分光光度計を使用して外径を測定します.
      注意:グリセロールストックから細菌をストリーキングするために使用されるLB寒天プレートとは対照的に、液体LB培地にはテトラサイクリンが含まれていてはなりません。
   4. マルチピペットを使用して、各細菌培養物(lin-53または空のベクター)を6 cm NGM-Agar RNAiプレートに500 μL加えます。蓋を閉めた状態でプレートを室温で一晩、暗所でインキュベートして乾燥させます。この間、NGMプレートのIPTGは、細菌のdsRNAの産生を誘導します。
      1. 1回の実験につき、細菌培養ごとに少なくとも3枚のプレートを使用してください。これにより、各実験に対して 3 回のテクニカル リピートが提供されます。
   • 乾燥させたNGM-寒天RNAiプレートをバクテリアと一緒に4°Cの暗所で最大2週間保存してください。
3. C.エレガンス株BAT28の調製
4. 標準的なNGM-Agarプレートを用いて、OP50細菌に導入遺伝子otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)]およびntIs1 [gcy-5prom::gfp]を含む線虫BAT28を15°Cで維持します。
   注:線虫培養に関する詳細なプロトコールについては、以下を参照してください。rol-6(su1006)は、優性対立遺伝子であり、典型的なローリング運動を引き起こす一般的に使用される表現型注射^{マーカー16}である。otIs305導入遺伝子でhsp-16.2prom::che-1を追跡するために使用されます。
   1. hsp-16.2prom::che-1導入遺伝子の慎重な活性化を防ぐために、BAT28株は常に15°Cに保ってください。ひずみをできるだけ扱いながら、15°Cを超える温度への暴露を減らしてください。
5. ワームをエイジシンクロさせるには、漂白技術を使用します。
   1. 成虫とBAT28の卵が入った6 cm NGM-Agarプレートを900 μL M9バッファーで洗い流します。ワームを900 x gで1分間遠心分離してペレット化します。上清を取り除きます。
   2. 0.5〜1 mLの漂白液を加え、成虫が破裂し始めるまでチューブを約1分間振とうします。標準的な実体顕微鏡を使用してモニターします。
   3. 900 x gで1分間遠心分離してワームをペレット化し、上清を取り除きます。
   4. 800 μLのM9バッファーを加え、900 x gで遠心分離して、ワームペレットを3回洗浄します。
   5. 洗浄した卵を、OP50バクテリアを播種した新鮮なNGMプレートに置きます。OP50細菌の漂白集団を15°CでL4段階に達するまで増殖させます(約4日間)。L4幼虫は、標準的な実体顕微鏡を使用して、線虫の腹側に沿って約半分の白い斑点で認識できます.
      注:lin-53が枯渇した際の生殖細胞からニューロンへの変換表現型を達成するためには、親世代(P0)で枯渇させる必要があります。変換表現型のスコアリングは、次の世代(親孝行世代F1)で行われます。すでにP0にある枯渇したlin-53を達成するために、L4動物にRNAiを投与する。
6. 1回の複製につき50個のL4ステージワームを、白金線を使用して細菌を含まないNGMプレートに手動で移し、転写されたOP50細菌から線虫を遠ざけます。ワームをプレート上で約5分間動かします。以前にlin-53 RNAi細菌を播種したNGM-Agar RNAiプレートの細菌(またはエンプティベクターコントロール)を使用して、それぞれのRNAiプレートに移します。
   1. OP50 細菌を実際の RNAi プレートに移すことは避けてください。ひずみが15°Cを超える温度にさらされる時間を最小限に抑えるために、迅速に作業してください。
7. NGM-Agar RNAiプレート上で、寄生虫のF1子孫がL3 – L4段階に達するまで、約7日間、寄生虫をインキュベートします。P0の動物はF1の子孫よりも大きくて厚いため、P0の動物とは明確に区別できます。
   1. 図1に示すように、F1子孫の線虫が突出した外陰部(pvul)の表現型を示すかどうかを標準的な実体顕微鏡で視覚的に確認します。lin-53に対するRNAiは多面発現効果を持ち、lin-53に対するRNAiが成功したかどうかを評価するために使用できるpvul表現型を引き起こします
      注:lin-53に対するRNAiもF1胚の致死性を引き起こす可能性があります。この効果は、動物がL3 – L4段階に到達する前にプレートが15°Cを超える温度にさらされると増加します。死んだ胚は、発生の停止と孵化の欠如によって認識できます。
   2. IPTGは光感受性であるため、暗闇でプレートをインキュベートします。

結果

図1:lin-53に対するRNAiによるPvul表現型 (上)対照またはlin-53 RNAiで治療した母親に由来するL4/若年成人期F1子孫ワームのDIC写真。スケールバー = 20 μm. (下) lin-53 RNAi で処理した動物は、突出した外陰部 (pvul) の表現型 (黒の矢印) を示します。pvulの表現型は、lin-53に対するRNAiが成功したことを確認しています。スケールバー = 20 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
化学品
寒天・神戸I	ロス	5210.1
バクトペプトン	A.ハルテンシュタインGmbH	211 677	ペプトンメディア
酵母エキス	アプリケム	1552,0100円
アムホテリシンB	USBiology(USBiology)	A2220(英語
CaCl2	メルクバイオサイエンス	208290
コレステロール	ロス	8866.2
ゼラチン	ロス	4275.3
IPTGの	シグマ	15502から10G
K2PO4	ロス	T875.2
KH2PO4	ロス	3904.2
MgSO4	VWRの	25,163,364
Na2HPO4	ロス	P030.1
NaCl	ロス	9265.1
NaClO	ロス	9062.3
NaOH (5 N)	ロス	KK71.1
トリス	ロス	AE15.2
カルベニシリン	ロス	634412
テトラサイクリン	ロス	2371.2
インキュベーター
インキュベーター	三洋電機 MIR-5	5534210	15 °Cまたは25 °Cでのウォーム株の維持用
>顕微鏡
実体顕微鏡	SMZ745	ニコン
>細菌株
大腸菌HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (IPTG誘導性T7ポリメラーゼ) (RNAseIIIマイナス).
大腸菌 OP50			ウラシル補助栄養大腸菌株
>ワーム株
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			OH9846からN2との4倍のバッククロッシングによって得られ
RNAiクローン
LIN-53	ソースBioscience	IDはI-4D14	アーリンガーライブラリ16B07 ChromI、K07A1.12
空のベーター:L4440	アドジーン	#1654

) さん 千株 の ます です