液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

要約

出典:Groh, N. et al.Caenorhabditis elegansにおける年齢に伴う固有タンパク質凝集の変化を研究する方法. J. Vis. Exp.(2017年)。

RNAiは、C.エレガンスの研究者が利用できる強力な遺伝ツールです。この動画では、液状培養条件を利用して、プレートフィーディングよりも多くの線虫をRNAiで処理する方法を紹介しています。

プロトコル

このプロトコルは、Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. 目的の遺伝子を標的としたRNAiを施した若齢動物と老齢動物を採取するための生殖腺のない動物の液体培養

注:RNAiに対する一部の遺伝子の応答は、前述のように温度に依存する場合があります。RNAiの代替として、変異遺伝子をgon-2(-)バックグラウンドに組み込むことができます。

1. 液体培養用細菌の調製
   1. OP50およびRNAi細菌(目的のdsRNAを産生する細菌および空のベクターをコントロールとする細菌)を4 L LB培地に12 mLのそれぞれの細菌培養液を接種して調製し(最終濃度の50 μg/mLカルベニシリンと1 mM IPTGをRNAi細菌培養物に添加)、37°Cで180 rpmで一晩インキュベー
   トします。
   2. 翌日、培養物を6,700 x gで4°Cで10分間収穫し、上清を取り除き、各ペレットを60 mLの氷冷S基礎培地(100 mM NaCl、50 mM リン酸カリウムpH 6、氷上に保持)に再懸濁します。再懸濁した3つのペレット(OP50、コントロールRNAi細菌、および目的遺伝子のRNAi細菌)をステップ1.2まで4°Cに保ちます
      注:線虫は、L1段階からRNAi上で増殖させるか、または最後の幼虫期L4からの発生上の欠陥を避けるために増殖させることができます(ステップ1.2を参照)。
2. 最後の幼虫期L4から始まるRNAiによる治療のための液体培養
   1. 200 mL のS基礎培地をFernbach培養フラスコ(容量2,800 mL)に加えます。最終培養量を300 mL(1.2.2.4を参照)にするには、10 mMクエン酸カリウム、pH 6、3 mL微量金属溶液(5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2.5 mM FeSO₄、1 mM MnCl₂、1 mM ZnSO₄、0.1 mM CuSO₄)、3 mM MgSO₄、3 mM CaCl₂、100 ng/mLカルベンダジム、および5 μg/mLコレステロール)を加えます。フラスコをメンブレンスクリューキャップで閉じます。バッファのレシピについては、表 1 を参照してください。
   2. L1を25°Cから取り出し、15 mLチューブに移します。1,900 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、2 μLあたりのL1をカウントします。前のステップで調製したFernbach培養フラスコに500,000個のL1を加えます。
   3. OP50(手順1.1から)をワームの数に比例して追加します。たとえば、500,000匹の線虫の場合、60mLのOP50を追加します。
   4. S基底部による完全な線虫培養により、総容量を300 mLにします。150 rpmの振とうインキュベーターで、25°CのL4ステージまでワーム培養物をインキュベー
   トします。
   5. 翌日、線虫は野生型のL4のサイズになっているはずです。OP50からRNAi細菌に変更するには、50 mLチューブ6本に動物を採取し、沈殿させて上清を除去します。L4をM9で洗浄して残留OP50細菌を除去します:1900 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、すべてのL4を1本の50 mLチューブに移します。5 μL あたりの L4 を数えます (少なくとも 9 回)。若い線虫の収集には 2 倍の 50,000 L4 が必要であり、老齢線虫の収集には 2 倍の 100,000 L4 が必要です。
   6. 1.2.2.1で説明されているように、4つのFernbach培養フラスコを準備します。また、最終濃度の50 μg/mLカルベニシリンと1 mM IPTGを各フラスコに加えます。
   7. 線虫の数に比例して、コントロールRNAi細菌と目的遺伝子のRNAi細菌(ステップ1.1から)を追加します:若い線虫の場合はフラスコあたり7 mL、老化した線虫の場合はフラスコあたり14 mLのそれぞれの細菌を追加します。
   8. 若い線虫のコレクションにはフラスコあたり50,000匹の線虫を、老齢線虫のコレクションにはフラスコごとに100,000匹の線虫を追加し、S基底で培養を完了させて最大300 mLまで充填します。ワーム培養物(合計4個)を25°Cおよび150rpmでインキュベー
   トします。

2. C. elegansの液体培養の維持

1. 各液体培養物から定期的にアリコートを採取し、スライドガラス上(または寒天プレート上)に置いて、汚染がないことを確認します。解剖顕微鏡を使用して、特に成長期に培養中の細菌の食物レベルを確認します。ステップ1.1で説明したように、コントロールRNAi細菌および目的遺伝子のRNAi細菌の2 L培養物を事前に調製します。必要に応じてこれらをC.エレガンス液体培養物に加え、残りは4°Cに保ちます。
2. 動物が無菌状態であることを定期的に確認してください。大多数の動物は生殖腺を持っていません。gon-2変異の浸透度によっては、性腺構造が中絶しているものもありますが、卵を持つ動物は観察されません。

。

ストックソリューション	量	最終濃度	コメント/説明
S基底(500mLの場合:5.9 g NaCl, 50 mL 1 M リン酸カリウム pH 6)	200ミリリットル		1 M リン酸カリウム pH 6: 1 L の場合: 129 g KH2PO4 一塩基性、 52 g K2HPO4二塩基性無水物
1 M クエン酸カリウム pH 6 (400mLの場合:13.1gクエン酸一水和物、 134.4 gの三カリウムのクエン酸塩の一水和物)	3ミリリットル	10 mM
微量金属溶液 (1 Lの場合:1.86 g エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、 0.69 g FeSO4・7 H2O, 0.2 g MnCl2 ・ 4 H2O, 0.29 g ZnSO4・7 H2O, 0.025 g CuSO4 ・ 5 H2O)	3ミリリットル		原液は暗所4°Cで保存してください
1 M MgSO4 (500 mL の場合: 123.3 g)	900μL	3メートル
1 M CaCl2 (500 mLの場合:73.5 g)	900μL	3メートル
200 μg/mL カルベンダジム (50mLの場合:メタノール中10mg)	150μL	100 ng/mL
5 mg/mL コレステロール (100mLの場合:エタノール0.5g)	300μL	5 μg/mL

>表 1.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Fernbach文化フラスコ	コーニング	4425-2XL	パイレックス、容量2,800 ml、3つのバッフルインデント付き	はい
メンブレンスクリューキャップ	ショット	1E+06	GL45	はい
章動ミキサー	VWRの	444-0148		はい
セパリーファンネル	ナルゲン	4300〜1000	容量 1,000ml	いいえ
1mlシリンジ	BDプラスティパック	3E+05		いいえ
グレーの針、27 G x 1/2 "、0.4 mm x 13 mm	BDマイクロランス3	3E+05		いいえ
メンブレンフィルター 0.025 μM	ミリポア	VSWP04700		いいえ
pHストリップ	マシェリー・ナーゲル	92110	pH固定0-14	いいえ
プロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	5E+09	完全なMini EDTAフリータブレット	いいえ
オクトキシノール-9	アプリケム	A1388	トリトンX-100	いいえ
4-モルホリンエタンスルホン酸(MES)	シグマ・アルドリッチ	M1317		いいえ
ノニルフェニルポリエチレングリコール	アプリケム	A1694 (英語	ノニデットP40(NP40)	いいえ
DNaseIの	ロシュ	5E+09	組換え、RNaseフリー	いいえ
RNaseAの	プロメガ	A7973 (英語	解決	いいえ
総タンパク質ブロット染色	サーモフィッシャー	S11791	Sypro Rubyタンパク質ブロット染色	いいえ
総タンパク質ゲル染色	サーモフィッシャー	S12001	Sypro Rubyタンパク質ゲル染色剤	いいえ
TCEP(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩)	セルバ	36970		いいえ
ヨードアセトアミド	セルバ	26710		いいえ
重炭酸アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	9830		いいえ
シーケンシンググレード修飾トリプシン	プロメガ	V5111		いいえ
相対定量および絶対定量のための同重体タグ	サイエックス	4E+06	iTRAQ試薬マルチプレックスキット	いいえ
遠心分離機 Avanti J-26XP	ベックマン・コールター	4E+05		はい
超遠心分離機 Optima Max-XP	ベックマン・コールター	4E+05		いいえ
遠心分離機 5424R	エッペンドルフ	5E+09		はい
遠心分離機 5702	エッペンドルフ	6E+09		はい
遠心分離機 Megafuge 40R	サーモサイエンティフィック	8E+07		いいえ
コンセントレータープラス	エッペンドルフ	5E+09	遠心式蒸発器	いいえ
蛍光実体顕微鏡 M165 FC	ライカ		Planapo 2.0x対物レンズ付き	いいえ
解剖顕微鏡	ライカ		ライカ S6E	はい
高倍率顕微鏡 ツァイス アクシオ オブザーバー Z1	ツァイス		PlanAPOCHROMAT 20x対物レンズとZeiss Axio Cam MRm付き	いいえ
ソフトウェア				いいえ
画像解析ソフトウェア	イメージJ			いいえ
質量分析データの解析	プロテインプロスペクター		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	いいえ
大腸菌株
OP50	CGCの
RNAi細菌
L4440	Julie Ahringer RNAiライブラリ
C.エレガンス変異体
CF2253	CGC、株名:EJ1158		遺伝子型: gon-2(q388)
C.エレガンストランスジェニック
DCD214	DZNE TübingenのDella Davidの研究室		遺伝子型: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
DCD215	DZNE TübingenのDella Davidの研究室		遺伝子型: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

の の の 版) )