液体培養におけるRNAiフィーディング:C.エレガンスにおける遺伝子発現をノックダウンするためのハイスループット法

このプロトコルは、Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

1. 目的の遺伝子を標的としたRNAiを施した若齢動物と老齢動物を採取するための生殖腺のない動物の液体培養

注:RNAiに対する一部の遺伝子の応答は、前述のように温度に依存する場合があります。RNAiの代替として、変異遺伝子をgon-2(-)バックグラウンドに組み込むことができます。

1. 液体培養用細菌の調製
   1. OP50およびRNAi細菌(目的のdsRNAを産生する細菌および空のベクターをコントロールとする細菌)を4 L LB培地に12 mLのそれぞれの細菌培養液を接種して調製し(最終濃度の50 μg/mLカルベニシリンと1 mM IPTGをRNAi細菌培養物に添加)、37°Cで180 rpmで一晩インキュベー
   トします。
   2. 翌日、培養物を6,700 x gで4°Cで10分間収穫し、上清を取り除き、各ペレットを60 mLの氷冷S基礎培地(100 mM NaCl、50 mM リン酸カリウムpH 6、氷上に保持)に再懸濁します。再懸濁した3つのペレット(OP50、コントロールRNAi細菌、および目的遺伝子のRNAi細菌)をステップ1.2まで4°Cに保ちます
      注:線虫は、L1段階からRNAi上で増殖させるか、または最後の幼虫期L4からの発生上の欠陥を避けるために増殖させることができます(ステップ1.2を参照)。
2. 最後の幼虫期L4から始まるRNAiによる治療のための液体培養
   1. 200 mL のS基礎培地をFernbach培養フラスコ(容量2,800 mL)に加えます。最終培養量を300 mL(1.2.2.4を参照)にするには、10 mMクエン酸カリウム、pH 6、3 mL微量金属溶液(5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、2.5 mM FeSO₄、1 mM MnCl₂、1 mM ZnSO₄、0.1 mM CuSO₄)、3 mM MgSO₄、3 mM CaCl₂、100 ng/mLカルベンダジム、および5 μg/mLコレステロール)を加えます。フラスコをメンブレンスクリューキャップで閉じます。バッファのレシピについては、表 1 を参照してください。
   2. L1を25°Cから取り出し、15 mLチューブに移します。1,900 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、2 μLあたりのL1をカウントします。前のステップで調製したFernbach培養フラスコに500,000個のL1を加えます。
   3. OP50(手順1.1から)をワームの数に比例して追加します。たとえば、500,000匹の線虫の場合、60mLのOP50を追加します。
   4. S基底部による完全な線虫培養により、総容量を300 mLにします。150 rpmの振とうインキュベーターで、25°CのL4ステージまでワーム培養物をインキュベー
   トします。
   5. 翌日、線虫は野生型のL4のサイズになっているはずです。OP50からRNAi細菌に変更するには、50 mLチューブ6本に動物を採取し、沈殿させて上清を除去します。L4をM9で洗浄して残留OP50細菌を除去します:1900 x gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、すべてのL4を1本の50 mLチューブに移します。5 μL あたりの L4 を数えます (少なくとも 9 回)。若い線虫の収集には 2 倍の 50,000 L4 が必要であり、老齢線虫の収集には 2 倍の 100,000 L4 が必要です。
   6. 1.2.2.1で説明されているように、4つのFernbach培養フラスコを準備します。また、最終濃度の50 μg/mLカルベニシリンと1 mM IPTGを各フラスコに加えます。
   7. 線虫の数に比例して、コントロールRNAi細菌と目的遺伝子のRNAi細菌(ステップ1.1から)を追加します:若い線虫の場合はフラスコあたり7 mL、老化した線虫の場合はフラスコあたり14 mLのそれぞれの細菌を追加します。
   8. 若い線虫のコレクションにはフラスコあたり50,000匹の線虫を、老齢線虫のコレクションにはフラスコごとに100,000匹の線虫を追加し、S基底で培養を完了させて最大300 mLまで充填します。ワーム培養物(合計4個)を25°Cおよび150rpmでインキュベー
   トします。

2. C. elegansの液体培養の維持

1. 各液体培養物から定期的にアリコートを採取し、スライドガラス上(または寒天プレート上)に置いて、汚染がないことを確認します。解剖顕微鏡を使用して、特に成長期に培養中の細菌の食物レベルを確認します。ステップ1.1で説明したように、コントロールRNAi細菌および目的遺伝子のRNAi細菌の2 L培養物を事前に調製します。必要に応じてこれらをC.エレガンス液体培養物に加え、残りは4°Cに保ちます。
2. 動物が無菌状態であることを定期的に確認してください。大多数の動物は生殖腺を持っていません。gon-2変異の浸透度によっては、性腺構造が中絶しているものもありますが、卵を持つ動物は観察されません。

>表 1.