4ウェイ嗅覚計アッセイ:ショウジョウバエの匂い物質手がかり反応を評価する方法

要約

出典:Lin, C.C., et al. Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer.J. Vis. Exp.(2016年)。

ショウジョウバエは複雑な嗅覚システムを持ち、何百もの匂い物質を識別でき、嗅覚を使って行動の決定を指示することができます。このビデオでは、ハエの嗅覚行動反応を研究する方法である4ウェイ嗅覚計アッセイについて説明します。注目のプロトコルクリップは、テストフライの取り扱い方法と、アッセイを実行する際の重要なステップを示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。

1. 匂い物質に対する行動反応

1. 温度コントローラーのスイッチを入れ、25°Cに設定します。
2. 臭気チャンバー(制御およびテスト臭気)を臭気チャンバーの出口とビヘイビアボックスのプッシュ接続フィッティングに挿入して、臭気チャンバー(制御およびテスト臭気)を接続します。
3. エアフローメーターを使用して各象限の流量をチェックし、制御気流と臭気物質の気流が100 ml / minに等しいことを確認します。
4. PTFEフライアリーナとガラスプレートを70%エタノールで2〜3回洗浄し、完全に風乾させます(~3〜4分)。
5. ガラス板をアリーナにクランプで固定します。
6. CO₂麻酔なしで、ガラス板の1つの穴からアリーナに飛んでいきます。転写後、ハエが逃げないように穴に円形のメッシュを配置します。
   注:CO₂麻酔はショウジョウバエの行動に影響を与えることが示されており、行動実験から24時間以内に使用しないでください。
7. ハエのいるアリーナを光密チャンバーに配置し、ビヘイビアボックスのプッシュツーコネクトフィッティングに取り付けられたチューブをアリーナの角に接続して4つの制御空気流を接続し、チャンバーのドアを閉じて、ハエが新しい環境に順応するまで10〜15分待ちます。可能であれば、実験結果に偏りを与える可能性のある最小限の光漏れを避けるために、実験が行われる部屋の照明をオフにしてください。
8. ハエを4つの制御空気流にさらす5〜10分間の制御実験を実行します。
9. データをすぐに分析し(以下の「データ分析」セクションを参照)、ハエがアリーナに均一に分布していること、およびアトラクションインデックスが0に近いことを確認します。このステップは、アリーナ内に制御されていない嗜好や回避の原因(外部からの光の漏れ、不均一な温度分布、不均一なアリーナ、臭気の汚染など)がないことを確認するため、不可欠です。ハエが不均等に分布している場合、またはハエの自発運動活動が低い場合は、ハエを捨て、アリーナを再度清掃し(ステップ1.4)、新しいハエのバッチを使用して実験を繰り返します。
10. 3方向バルブをオンにするか、コネクタチューブを再度差し込むことにより、テスト臭気チャンバーをセットアップに接続します。
11. テスト実験を5〜10分間実行し、以下のセクション2で説明したようにデータを分析します（図1)。20分を超える録音は、計算処理が困難なデータファイルになる可能性があります。より長い実験記録が必要な場合は、追跡プログラムを迅速に停止して再開します。これにより、実験記録の間には~10秒のギャップが生じます。
12. ハエを捨てます。
13. アリーナとガラスプレートを70%エタノールで清掃し(ステップ1.4)、遮光性のあるエンクロージャ内のコネクタチューブを交換します。実験を迅速化するために、新しいクリーンなアリーナを使用し、実験の実行中に汚れたアリーナを清掃することができます。
14. 必要に応じて、新しいハエのバッチで別の実験を実行します。同じ日に複数の実験を行う場合は、前回のテスト実行で使用した臭気物質がシステムに残らないように細心の注意を払ってください。これは通常、低濃度の匂い物質やCO₂では問題になりませんが、高濃度の刺激では、実験の実行間に最大24時間の間隔が必要になることがあります。さらに、制御実験中に臭気物質の汚染が疑われる場合は、フローチューブの後のすべてのチューブを交換することができます。実験の合間には常に乾燥空気をオンのままにして、システムを連続的に洗浄します。

2. データ分析

注:推奨されるハエ追跡取得ソフトウェア（「参考文献」で詳述)は、取得中にリアルタイムでハエを追跡し、検出されたすべてのハエのタイムスタンプと座標を*.dat形式で保存します。データをMatlab形式に変換し、データを分析するためのカスタムメイドのMatlabルーチンを開発しました。コード例は補足資料に記載されていますが、実装の詳細はデータ集録に使用するソフトウェアによって異なります。

1. 生データを読み込みます。アリーナの輪郭をたどる空間マスクを作成し、そのマスクを生データに適用して、ノイズを表すためにアリーナの外側にあるすべてのデータポイントを削除します (図 2A、補足コード MaskSpatialFiltering.m、Score.m、DrawCircularMask.m)。
2. 0.163 cm/s 未満の速度で 3 秒以上移動するデータ点は、ノイズであるか、動かないハエによって生成される可能性が高いため、すべて削除します (図 2B、補足コード TemporalFiltering.m)。
3. 残りのデータ・ポイントを一度にプロットするか、単一の軌跡としてプロットして視覚化します (図 1、補足コード SingleTrajectoryViewer.m).
   注:4つのフィールドにおける臭気境界の位置は、各臭気物質の特性や使用される空気流量など、さまざまな要因に依存する可能性があります。たとえば、揮発性の高い匂い物質は、揮発性の低い匂い物質よりも臭気象限を完全に満たす可能性があります。したがって、各臭気物質はわずかに異なる臭気境界を示す可能性があります。光イオン化検出器を使用して臭気境界を測定すると、真空を使用して特定のスポットから空気をサンプリングし、そのスポットの臭気濃度を乱すため、問題となる可能性があります。それにもかかわらず、ハエの行動データに基づいて、臭気の境界を迅速に推定することができます。例えば、異なる臭気に応答して累積されたフライトラックに基づく臭気境界は、Figure 1C および 1D で明確に観察できます。
4. 引き寄せ指数を計算して、対照実験が選好反応を引き起こさないかどうかを判断し、匂い物質(または光遺伝学的)刺激に対する反応にアクセスします。Attraction Index(AI)を計算するには、コントロールまたはテスト記録の最後の5分間を使用します。+1 (絶対引力) と -1 (絶対反発力) の間の引力の尺度を得るために、次の式を使用して AI を計算します:
   
   ここで、N_検定はテスト象限のデータ ポイント数、N_制御は 3 つの制御象限のデータ ポイントの平均数です。この測定値は直感的であり、ゼロに近い値で選好は示されません。ただし、匂い象限にあるハエの総数の割合は正しく示されていません。この尺度を取得するには、パーセンテージ指数(PI)を使用できます:
   
   ここで、N_testはテスト象限のデータポイント数、N_totalは4つの象限すべてのデータポイントの合計数です。この式は、0 から 1 の間に収まる尺度を提供し、0.25 は行動選好なしに対応します (図 1E および 2C、補足コード AttractionIndex.m)。
5. 各実験条件を5〜10回繰り返し、リピートごとに新しいハエのグループを使用します。Kolmogorov-Smirnov ノンパラメトリック検定 (図 1 F、Matlab の kstest2 関数) を使用して、条件間またはコントロールに対して引力指数を比較します。

結果

図1:4フィールド嗅覚アッセイを使用して生成されたデータの例。(A)4フィールドアリーナの概略図。(B)中立的な応答は、4つの象限すべてに乾燥空気の灌流のみが含まれている場合に観察されます。(C)左上象限から灌流されたアップルサイダービネガーの6.25%希釈に対するアトラクションの反応。(D)10%プロピオン酸エチルによって引き起こされる反発挙動。図2B-2Dでは、取得したデータから1つの軌跡がプロットされています。色のグラデーションは、録音の時間経過を示すために使用され、青と赤の色がそれぞれ録音の開始と終了です。(e)引力指数(AI)とパーセンテージ指数(PI)の比較。(F)無臭(コントロール)、アップルサイダービネガー(ACV)、1...

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