ショウジョウバエY迷路アッセイ:ハエの嗅覚反応を評価する方法

要約

出典:Simonnet, M. M., et al. Y 迷路アッセイによるショウジョウバエの嗅覚試験。J. Vis. Exp.(2014年)。

このビデオでは、ショウジョウバエの嗅覚探索行動をテストする方法、Y迷路について説明しています。注目のプロトコルクリップは、アッセイのセットアップ方法と実施方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルテキストは、Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014)からの抜粋です。

1. 始める前に

1. 安定した堅牢な行動表現型を持つ等価化された参照ストックを使用してください。この株を選択するための一般的なルールはありません、なぜなら、すべての潜在的なコントロールは不均一な背景対立遺伝子を持っているかもしれないからです。
2. この制御株を使用して、後のステップに必要な他のすべてのストックを戻し交配します。この戻し交配ステップは、典型的には、1人の処女女性(相同染色体間の可能な交差を可能にするため)と2〜3人の同質遺伝子参照男性の少なくとも5回の連続した交配によって表される。このステップは、異なるハエストック間の遺伝的背景を均質化するために重要です。
3. ショウジョウバエのストックを、標準的なトウモロコシ粉(9%)、酵母(10%)、寒天培地(1.5%)に抗生物質(0.4%パラヒドロキシ安息香酸メチル)を添加し、25°Cで12時間の明暗サイクルで維持します。
4. 温度制御された部屋(25°C)で遠方赤色光の下で化学感覚実験を行います(視覚的な手がかりの寄与を排除し、化学感覚信号に焦点を当てるため)。各実験の間のエリアを換気するために、部屋の空気を定期的に更新します。

2. Y迷路アッセイを用いた嗅覚反応

1. 試験前に、濡れたペーパータオルの入ったガラス管で25°Cで16〜18時間ハエを飢餓状態にします。
2. Y字型コネクタを2つのガラスバイアルと小さなプラスチックバイアル(ローディングバイアル)に結合します。フォームストッパーを通過する1mlのピペットチップを使用して、コネクタを3つのバイアルにリンクし、しっかりと密封されたY迷路を取得します。2つのピペットチップの狭い端(ハエが決定を下した後、ハエが戻らないように直径~2mm)をカットして2つの「トラップ」バイアルを形成し、1つのピペットチップの大きな端を「ローディング」チューブを形成します(図1A)。
3. 「トラップ」バイアル(図1 B)を接続する直前に、各バイアルに直径~6 mmの濾紙を1枚入れます。1枚の濾紙に40μlの臭気溶液を、2枚目の濾紙に40μlの対応する溶剤を加えます。
4. 生後4〜9日のハエ10匹を「ローディング」バイアルに入れます。この移動中は、行動に強い影響を与えるため、CO₂麻酔を使用しないでください。むしろ、氷の上で短時間冷却します。麻酔をかけたハエを適切に操作することは、被験者へのストレスをできるだけ抑えるために重要です。
   1. 遠赤色光の下で25°Cで一連のY迷路テストを実行し(LED電球を使用して可能な熱源を制限します)、視覚刺激をできるだけ避けます。Y迷路の向きを変えるように注意してください(左側または右側に臭気物質を含むチューブ、および前面または背面にロードチューブ。図 1C)。
   2. ハエが臭気物質または溶剤を含むトラップバイアルに入るまで数時間待ちます。カウントは24時間後に飛んで、参加を80%以上まで増やし、最大の嗅覚指数値を提供します(Simonnet、私信)。
   3. 次の式を使用して、結果の嗅覚指数を計算します:(臭気管内の数-溶媒管内の数)/ロードされたハエの総数。
5. Y-mazeのセットアップを次のように洗浄します:分解したセットアップをRBS 35 MDに一晩浸します。水道水で十分に洗い流してください。最後に脱イオン水ですすぎ、乾かします。

3. データの統計分析

1. データと変数に応じて、t検定、一元配置分散分析、または二元配置分散分析を実行します。

結果

図1:Y字迷路のセットアップで評価された男性の嗅覚反応。A)デバイスを分割します。B)組み立てられたデバイス。C)遠赤色光の下での作業状態でのセットアップ。D)酢酸(AA)またはフェニル酢酸(PAA)の両方を蒸留水(10%v / v)で希釈した男性の嗅覚反応の定量化(N = 11、合計110匹のハエに相当)。統計分析は、データを0と比較するt検定を使用して実行されました。0 は優先しないことを意味します。負の値は臭気物質に対する嫌悪感を示し、正の値は魅力を示します。: p < 0.0001;ns: 有意でない (p = 0.1680)。

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント ショウジョウバエポリスチレンチューブ VWRヨーロッパ 〒734-2255 30 x 25 mm Y字迷路 ショウジョウバエホウケイ酸チューブ ディジョン・ヴェール 95 X 25 mm Y字迷路 フォームストッパー ダッチャー 999038 Y迷路 Y字型コネクタ ユーロプリ 11020605 Y迷路 100-1,000 μl ピペットチップ コーニング 4868名 次のピペットチップをY字型コネクタに結合します。幅の広い端から 65 mm のところで 2 つのピペットチップを切り取り、狭い端 (~2 mm の開口部付き) を 2 つのテストバイアルに接続します。
これらの開口部は、ハエが臭気を含むチューブに入ると、Uターンを制限します。幅の広い端から35mmのところで1つのピペットチップを切り取り、ローディングバイアルに接続します。 遠赤色LED電球 ルビン・ラカック 0RB180238 625-630 nm 酢酸 シグマ・アルドリッチ 45725 フェニル酢酸 シグマ・アルドリッチ P16621 酵母 センシエントフレーバーストラスブール 1018880464 コーンミール ユーロジャーム ファリーヌ・ド・マイス 寒天 カリス HP-697-25 安息香酸メチルヒドロキシ4 VWRインターナショナル 25605293