ショウジョウバエの生胚へのマイクロインジェクション:発生中の胚への試薬の早期送達

要約

出典:Brust-Mascher、I.、Scholey、JM ショウジョウバエメラノガスター合胞体胚の有糸分裂を研究するためのマイクロインジェクション技術。J. Vis. Exp.(2009年)。

このビデオでは、生きたショウジョウバエの胚に試薬を送達するマイクロインジェクションの方法を説明しています。研究者は、この方法を使用して、胚発生の初期段階で核酸やタンパク質などの外因性化合物を導入できます。この注目のプロトコールは、任意の可溶性試薬(ここではライブイメージング実験用の蛍光タンパク質)の注入手順の設定方法と実行方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Brust-Mascher and Scholey, Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009)からの抜粋です。

レシピ:

Grape Juiceプレート:

• バクト寒天 5.5g

• 14.5 gのデキストロースまたはグルコース

• 7.15gのスクロース

• 45mlのグレープジュース濃縮物(100%ジュース)。

• 204.5ミリリットルH₂0

• 625 μl 10N NaOH

すべての材料を混ぜ合わせ、沸騰するまで電子レンジで加熱します。
2.8mlの酸ミックスを加えます(酸ミックス:20.9mlプロピオン酸、2.1mlリン酸、27mlH2 0)

35mmのシャーレに混ぜて注ぎます。室温で1〜2日間固化させます。プレートをすぐに使用しない場合は、パラフィルムで密封し、4°Cに保ちます(RTに平衡化してから使用してください)。

イーストペースト:
小さじ1杯の酵母(Sigma YSC2、Saccharomyces cerevisiae type II由来の酵母)を水に溶かして、濃厚なペースト状にします。使用直前に各グレープジュースプレートにこれを少量置きます。

インジェクションバッファ:

• 150 mM K-アスパラギン酸

• 10 mM K-リン酸

• 20 mM イミダゾール、pH 7.2

ヘプタン接着剤:
二重粘着テープを広げて100mlのボトルに入れ、約50mlのヘプタンを加えてボトルを密封し、数日間揺さぶる。使用時に、接着剤が厚すぎる場合はヘプタンを追加します。

脱水室:
100mmのシャーレに35mmのシャーレを一部入れて「テーブル」を作り、その周りにドライエライト(無水硫酸カルシウム)を加えて、ドライエライトの高さが「テーブル」より高くならないようにして覆います。胚の入ったカバーガラスは、注射前の脱水のためにこの「テーブル」に置かれます。少なくともいくつかの指示ドラライトを使用し、色が変わったときに交換することをお勧めします。

>プロトコル:
このプロトコルは、ショウジョウバエ合胞体胚へのほぼすべての可溶性試薬の注入に使用できます:例えば、観察用の蛍光タンパク質または標的タンパク質阻害剤、またはその両方。

1. 胚コレクション

1. 新しいグレープジュースプレートをレイケージに置きます。
2. 1時間後にこのプレートを取り外し、これはその日の最初のコレクションであり、多くの場合、あまり良くありません。破棄できます。
3. プレートを1時間ごとに交換して、1時間ごとに胚を収集し続けます。

2. カバースリップの準備

1. 顕微鏡スライドの片面に50 x 22mmのカバースリップを置きます。スライドが動かないように、四隅をスライドにテープで固定します。
2. 綿の先端のアプリケーターを使用して、ヘプタン接着剤の1つの層をカバーガラスの1つのラインに置きます(接着剤は粘性がなく、数秒で乾燥する必要がありますが、そうでない場合はヘプタンを追加します)。
3. カバーガラスの側面に向かってスライドに二重粘着テープを貼ります。

3. 胚の準備

注:胚は収集開始から約2時間後に画像化されるべきですので、この時間枠内でそれらを完了するための十分な時間を確保して次の手順を開始してください。

1. 湿らせたブラシで、ブドウジュースプレートから胚を慎重に拾い上げ、スライド上に二重粘着テープの上に置きます。
2. ピンセットの外側部分を使用して、絨毛膜(外膜)が壊れるまで、胚を二重粘着テープの上で転がします。
3. 胚を絨毛膜の上で優しく転がしてピンセットにくっつくようにして胚を拾い上げ、胚の長辺をカバーガラスの長辺と平行にして、カバーガラスのヘプタン接着剤の上に置きます。10〜20個の胚を1列にセットします。
4. カバースリップを取り外し、脱水チャンバーに3〜8分間置きます(これは部屋の湿度と注入量によって異なります)。
5. 真空グリースを入れた金属製のチャンバーに置きます。
6. 胚をハロカーボンオイル700で覆い、さらなる脱水症状を防ぎます。これで、胚を注入する準備が整いました。

4. 胚注入

1. 16倍の対物レンズの下で胚を見つけます。
2. 胚を遠ざけ、焦点面を動かさずに針を見つけます。
3. 針を中央に配置し、x方向またはy方向に動かさずに上に移動します。
4. 針が開いていない場合は、カバーガラスの端を視野に入れますが、針が来る場所には置かず、針を同じ焦点面に下げます。カバースリップが針に当たってそっと開くまで、カバースリップを非常に慎重に動かします。針が開いている場合は、手順5に進みます。(針は充填前にフッ化水素酸で開くことができます)。
5. 胚を視野に入れ(ただし、針がある場所ではなく)、針をオイルに下げて、針からきれいな液滴が得られることを確認します。
6. 胚を針に慎重に、しかし着実に移動させ、胚に一滴注入して胚を遠ざけます。(または、注射装置の指示に従ってください)。
7. すべての胚が注入された後、共焦点顕微鏡で観察する準備が整います。