光スポットアッセイ:ショウジョウバエの光走性挙動を調査する方法

要約

出典:Sun, Y., et al. Shot Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis.J. Vis. Exp.(2019年)。

ショウジョウバエの幼虫は光に敏感で、周囲の光の変化に反応します。このビデオでは、光スポットアッセイと呼ばれる、光を避ける能力をテストするアッセイについて説明します。この注目のプロトコルは、青色光LEDを使用してアッセイを設定する方法を示し、光の遭遇に応答した動物の行動を記録する方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルテキストは、Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2019年)。

1. イメージングシステムのセットアップ

1. 高解像度の Web カメラを、デスクトップの光点から約 10 cm 上に鉄のクリップで固定します (図 1)。
2. カメラレンズの向きをデスクトップに合わせます。カメラを USB インターフェイスでコンピュータに接続します。
3. 寒天プレートをデスクトップのカメラのすぐ下に置きます。
4. Windows 7を搭載したコンピューターで「Amcap9.22」ソフトウェアを開くと、AMcapのウィンドウに光点が自動的に表示されます。カメラを少し左または右に動かして、光点がウィンドウの中央近くにあることを確認します。カメラが光路を遮らないようにしてください。光点は完全で丸い必要があります.
   注:ソフトウェアは http://amcap.en.softonic.com/ にあります。
5. 850nm±3nmのバンドパスフィルターをカメラのすぐ下の5〜7mmにクリップで固定します
   注:フィルターの直径は約2.5cm、カメラレンズの直径は1cm未満なので、カメラの視野をフィルターでカバーすることができます。カメラの下にフィルターがあると、AMcapのウィンドウに光点が見えなくなります。
6. 赤外線を発するLED(中心波長=850nm)を3個、寒天板の周囲に均等に配置します。各LEDは寒天プレートの端から約5cm離れている必要があり、LEDのレンズ面は寒天プレートに対して70°下向きの角度にある必要があります。AC-DCコンバーターを介してLEDを電源に接続します.
   注:さまざまな実験的試験でフィールドの明るさの一貫性を確保し、後のビデオ処理を容易にするために、赤外線LEDの位置と角度を固定することをお勧めします。
7. コンピュータとデバイスの間に黒いボードを置きます。コンピューター画面の光が実験に影響を与えないように、コンピューター画面の明るさを下げます。
   注:光の波長や強度を測定するときは、環境を暗くしてください。

2. イメージングのパラメータを設定する

1. AMcap ソフトウェアのメニューで、[オプション] |ビデオデバイス |キャプチャ形式に設定し、キャプチャしたビデオのピクセル サイズを 800 x 600 に、フレーム レートを 60 fps に設定します。
2. カメラの下からフィルターを取り外し、カメラの下に定規を置き、カメラのフォーカスを調整して、スケールラインがビデオの視野の幅にはっきりと平行になるようにします。
3. [キャプチャ] |セットアップ |ビデオキャプチャして保存パスを選択し、[録画の開始]をクリックし、600ピクセルに対応する実際の距離を記録し、各ピクセルと実際の距離の比率を計算します。

3. 光回避行動の動画記録

1. すべての実験を通じて25.5°Cの温度を維持します。必要に応じてエアコンで室温を制御します。加湿器で湿度を常に60%に保ちます。
2. 「lightarea1」という名前のライトスポットの位置を短いビデオで撮影します。次に、850nm±3nmフィルターを戻して、カメラのレンズを覆います
   注:幼虫の行動を記録するとき、カメラのレンズは850nm±3nmのフィルターで覆われているため、光点がビデオに表示されません。光点は、後でMatlabを使用して幼虫のビデオで再構築できます。カメラの位置を変更したり、手順2.3で測定した実際の距離に対する各ピクセルの比率を変更したりしないでください。
3. 実験装置から遠く離れた照明(つまり、部屋の照明)を点灯します。幼虫が目ではっきりと見える限り、できるだけ光を下げてください。スプーンで幼虫を培地から取り出し、3番目の幼虫をそっと選び、蒸留水できれいに洗います。空腹による干渉を避けるために、幼虫を一度に1匹ずつ洗うように注意してください。1回の実験には、少なくとも20匹の幼虫が必要です。
4. 手順1.3でカメラの下に置かれた寒天プレートの中央に幼虫を移します。レンズの下の光の反射を防ぐために、ブラシで幼虫から余分な水分をそっと取り除くか、あぶらとり紙を使用して幼虫から水分を取り除きます。部屋の照明を消し、幼虫が暗い環境で2分間順応するのを待ちます。
5. LEDライトを点灯して赤外線を生成し、幼虫をプレートの中央にそっと磨きます。幼虫がまっすぐに這い始めたら、プレートを回転させて幼虫が光点に向くようにします。最初からまっすぐに這うようにしないと、光点にアクセスできない可能性があります。
6. [キャプチャ] |セットアップ |ビデオキャプチャをクリックして保存パスを選択し、[録画の開始]をクリックして録画します。幼虫が光点に向かって這うのを許し、光点に入り、次に光点が視野からほぼ外れるまで光点を離れます。[録音の停止] をクリックします。幼虫が近づく前に光点から離れる場合は、直接[録画の停止]をクリックします。
7. フィルターをカメラから離します。「lightarea2」という名前のライトスポットの位置を短いビデオで撮影し、「lightarea1」と比較して、ライトスポットの位置が変更されていないことを確認します。明らかな位置の変化が観察された場合は、データを破棄します。

結果

図1:実験のセットアップ。(A)光点ベースの幼虫高速走光性アッセイのセットアップの概略図。青い線は視覚刺激として使用される可視光の経路を表し、赤い線は赤外線の経路を表しています。矢印はライトの方向を示します。850nmのバンドパスフィルターは、赤外光を通過させますが、可視光を遮断します。(B)光スポットアッセイのセットアップの画像。画像は、より視覚化するために明るい条件下で撮影されたことに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント 850nm±3nmの赤外線LEDです Thorlabs, アメリカ PM100Aの 互換性のあるセンサー:フォトダイオードとサーマル
光パワー範囲a:100pW〜200W
利用可能なセンサー波長範囲a:185nm-25μmディスプレイリフレッシュレート:20Hz
帯域幅:DC-100 kHz
フォトダイオードセンサー範囲b:50 nA-5 mA
サーモパイルセンサ範囲b:1 mV-1 V AC-DCコンバータ Thorlabs, アメリカ S120VCシリーズ 開口部サイズ:Ø9.5 mm < br / > 波長範囲:200-1100 nm
電力範囲:50 nW-50 mW
検出器タイプ:Siフォトダイオード(UV拡張)
直線性:±0.5%
測定の不確かさ:±3%(440-980 nm)、±5%(280-439 nm)、±7%(200-279 nm、981-1100 nm) バンドパスフィルター Thorlabs, アメリカ DC2100 LED電流範囲:0-2 A
LED電流分解能:1mA
LED電流精度:±20mA
LED順方向電圧:24 V
変調周波数範囲:0-100 kHz正弦波
変調:任意 コリメートLEDブルーライト ELP, 中国 USBFHD01M 最大解像度:1920x1080
F6.0 mm
センサー:1 / 2.7インチCMOS OV2710 コンパクトなパワーメーターコンソール Ocean Optics(米国) USB2000+(RAD) 寸法:89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm
重量:190 g < br / > 検出器:ソニー ILX511B(2048素子リニアシリコンCCDアレイ)
波長範囲:200-850 nm
積分時間:1ミリ秒〜65秒(通常20秒)
ダイナミックレンジ:8.5 x 10 ^ 7(システム);1 回の買収で 1300:1
信号対雑音比:250:1(フル信号)
ダークノイズ:50 RMSカウント
グレーティング:2(250 – 800 nm)
スリット:SLIT-50
検出器収集レンズ:L2
順序の並べ替え:OFLV-200-850
光学分解能:~2.0 nm FWHM
迷光:600nmで<0.05%。435 nm
で<0.10% 光ファイバコネクタ:SMA 905〜0.22開口数シングルストランドファイバー ハイパワーLEDドライバ 中国、閩紅市 MHS-48XYシリーズ ワーキングvoltage:DC12V < br /> 中心波長:850nm 高解像度ウェブカメラ Thorlabs, アメリカ MWWHL4の カラー:ウォームホワイト
相関色温度:3000 K
一般的なLED電源のテスト電流:1000mA
最大電流(CW):1000mA
帯域幅(FWHM):N / A < br / > 電力:3000 mW
視野角(フルアングル):120°
エミッタサイズ:1 mm x 1 mm / br / >< 一般的な寿命: >50 000 h
動作温度(結露しないこと):0〜40°C
保管温度:-40〜70°C
リスクグループa:RG1 - 低リスクグループ LEDウォームホワイト Mega-9、中国 BP850/22K Ø25.4(+0~-0.1) mm
帯域幅:22±3nm
ピーク透過率:80%
中心波長:850nm±3nm 分光 器 ノエル・ダンジュー AMCAP9.22 AMCapは、高度なプレビューおよび録画機能を備えた静止画およびビデオキャプチャアプリケーションです。これは、Windows 7 SP1 以降を実行しているコンピューター用に設計されたデスクトップ アプリケーションです。
安価な Web カメラであろうと高度なビデオ キャプチャ カードであろうと、ほとんどの Windows 版 Video および DirectShow 互換デバイスがサポートされています。 標準フォトダイオードパワーセンサー スーパードラゴン(中国) YGY - 122000の 入力:AC 100-240V~50/60Hz 0.8A
出力:DC 12V 2A サーマルパワーセンサー Thorlabs, アメリカ M470L3-C1 カラー:ブルー
公称波長a:470 nm
帯域幅(FWHM):25nm
最大電流(CW):1000mA
順方向電圧:3.2 V
電力(最大):3200 mW
エミッタサイズ:1 mm x 1 mm / br / >< 一般的な寿命:100,000 h
動作温度(結露しないこと):0〜40°C
保管温度:-40〜70°C
リスクグループb:RG2 –中程度のリスクグループ サーマルパワーセンサー Thorlabs, アメリカ S401Cシリーズ 波長範囲:190 nm-20 μm
光パワー範囲:10 μW-1 W(3 Wb)
入力アパーチャサイズ:Ø10 mm < br / > アクティブ検出器エリア:10 mm x 10 mm
最大光パワー密度:500 W / cm2(平均)
直線性:±0.5%