幼虫の輪腺解剖:ショウジョウバエからの発生性内分泌器官の分離

要約

出典:Imura, E., et al. ショウジョウバエDrosophila melanogasterの免疫染色によるステロイド産生器官とその相互作用器官の可視化のためのプロトコル。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、エクジステロイドや他のホルモンの生合成と分泌に重要な複雑な内分泌構造であるショウジョウバエの輪腺について説明しています。注目のプロトコールは、その解剖、固定、および免疫染色を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

注: プロトコルの全体的なスキームは図 1 に示されています。

1. 幼虫環腺(RG)の解剖

注:シクロラファス双翅目に属するD. melanogasterでは、PGは環腺と呼ばれる複合内分泌器官内にあります(RG、図2D)。PGが他の種類の細胞(後述)から外科的に分離されることは不可能であるため、実用的な目標は、無傷で損傷を受けていないRGを解剖によって単離することです。

1. 適切な発育段階での幼虫の準備
   注:D. melanogaster幼虫の発生段階を同期させるためには、狭い時間内に卵を採取し、適切な時期に幼虫を採取する必要があります。
   1. 25°Cのブドウジュース寒天プレートで2時間卵を集めます。
   2. 新たに孵化した^1st instarの幼虫を鉗子付きの解剖顕微鏡で収集し、マッシュポテトの標準酵母/コーンミールフライフードが入った小さなバイアルに移します
      注:幼虫の年齢は、「産卵後数時間(hAEL)」、「孵化後数時間(hAH)」、「L3脱退後数時間後(hAL3E)」で表されます。
   3. 適切な時点で、望ましくない怪我を避けるために、使い捨てのプラスチックループでステージングされた幼虫を収集します。3^番目の幼虫の発達進行の違いを最小限に抑えるには、2^番目の幼虫を70 hAEL(48 hAH)で収集し、2時間間隔で脱皮させます。次に、L3 エックディスシス後 2 時間以内に 3^番目の幼虫を収集します。この手順により、0〜2匹のhAL3E幼虫が得られます。
   4. ステージングされた幼虫を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たされた皿に移します。
   5. 幼虫をPBSですすいで、体から残留食物を取り除きます。
2. 解剖顕微鏡による幼虫の粗解剖
   1. 鉗子で幼虫のマウスフックを保持します。幼虫の体を体長の3分の1前方でマイクロハサミで切断します。
   2. 前幼虫の体の切り口を1対の鉗子で保持します。もう一方の鉗子を使用して、頭の先端を体の内側に向かってそっと押します。この手順では、幼虫の体を裏返しにします。
      注:このステップは、1^匹目の幼虫の解剖のためにスキップできます。
   3. 手順1.2.1〜1.2.2を繰り返し、追加の幼虫を5〜10分間
      注:幼虫の数は、解剖の時間を節約するために20個以下である必要があります。
3. 免疫組織化学による組織の固定と染色
   1. 幼虫の体の前方の3分の1(ステップ1.2.2)を、500μLの固定溶液(PBS中の4%パラホルムアルデヒド)で満たされた1.5mLマイクロチューブに入れます。一度に20サンプル未満のサンプルを固定すると、固定サンプルにPBSが付着すると、固定剤が不利に希釈される可能性があります。フィレット解剖の場合は、PBSを一滴取り、次に固定液を一滴追加します.
      注:固定液には、3.7%ホルムアルデヒドまたは4%パラホルムアルデヒドのいずれかを使用できます。
   2. 解剖した組織を固定溶液中で室温(RT)で30分間、または4°Cで2時間インキュベー
   トします。
   3. 固定液を500 μL PBSと交換し、サンプルを3回すばやくすすぎます。サンプルを500 μL 0.3% PBT(PBS + 0.3%オクチルフェノールエトキシレート)でRTのロッカーで15分間洗浄します。フィレット解剖では、昆虫ピンを取り外し、サンプルを1.5mLのマイクロチューブに移します
      注:抗体の組織への透過性を高めるために、サンプルを500μLの2.0%PBTでRTのロッカーで1〜2時間処理します。
   4. PBTを500 μLブロッキング溶液(PBT中の2%ウシ血清アルブミン)に置き換えてください。サンプルをRTのロッカーで1.5時間インキュベートします。
   5. ブロッキング溶液を50 μLの一次抗体溶液、すなわちブロッキング溶液で希釈した抗体と交換します。
   6. サンプルをロッカーで4°Cで一晩インキュベートします。
   7. 一次抗体溶液を500 μL 0.3% PBTと交換し、サンプルを5回すばやくすすぎます。サンプルを500 μL 0.3% PBTで3回、RTのロッカーでそれぞれ15分間洗浄します。
   8. 0.3% PBTを二次抗体溶液(ブロッキング溶液で希釈した色素標識抗体)である50 μLに置き換えてください。核染色には、0.5 μL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI, 0.1 mg/mL ストック溶液) を 50 μL 溶液に添加します。サンプルをロッカーで室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします
      注:サンプルは暗所に保管してください。
   9. 抗体溶液を500 μL 0.3% PBTと交換し、5回すすぎます。サンプルを500 μL 0.3% PBTでRTで3回、各15分間RTで洗浄します。
4. PGを含む脳-RG複合体の微細解剖とマウンティング
   1. 使い捨てピペットを使用して、免疫染色されたサンプルを0.3% PBT.
      で満たされた皿に移します。 注:解剖および埋込中の不便な気泡を避けるために、0.3% PBTをPBSに置き換えることができます。
   2. 解剖顕微鏡で、キューティクルまたはマウスフックを1組の鉗子で保持します。1mLの注射器に取り付けた27Gの針を「ナイフ」として、食道と眼椎間板の前端を切断し、体内のキューティクルから脳-RG-眼椎間板複合体を切除します。
   3. 鉗子を使用して、食道と腸を脳-RG-眼椎間板複合体から分離します。食道は腹側神経索(VNC)より上の脳を通過するため、腸を後側に引き抜きます
      注:サンプルから余分な想像上の椎間板を取り除くには、ニードルナイフで脳、眼椎間板、脚椎間板の間の接続
   部を切断します。
   4. 他のサンプルについても手順1.4.1〜1.4.4を繰り返します.
      注:組織破片がサンプルに付着するのを防ぐために、完成した各サンプルを0.3%PBTまたはPBSで満たされた別の清潔な皿に移します。
   5. マイクロピペットできれいなスライドガラスの中央にサンプルを移します.
      注:2^番目または3^番目の幼虫の場合、マイクロピペットの先端の端をかみそりの刃で切り捨てる必要があります。
   6. 解剖顕微鏡下で、鉗子を使用して個々のサンプルを背側を上にして位置合わせします.
      注:RGは脳の背側にあります(図2A)。このアライメントにより、イメージング中の個々のサンプルの指定が容易になります。
   7. スライドガラスを傾けて、余分なPBTをできるだけ拭き取ります。スライドの側面にマウント試薬を一滴垂らします。ドロップの反対側からカバースリップの端を置き、鉗子でゆっくりとサンプルにカバースリップを置きます
      注:この手順により、サンプルがカバースリップの外側に移動するのを防ぎます。
   8. サンプルは4°Cで保存し、サンプルは暗所に保管してください。

結果

図1:プロトコルの全体的なスキーム。実験の目的に応じて、幼虫と成虫の雌に2つの異なる解剖方法を適用できます。また、サンプル条件に応じた実装方法も工夫されています。固定、染色、イメージングの技術は、基本的にすべてのサンプルに共通です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PGとPG投影ニューロンの可視化。(AおよびB

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
卵コレクション
組織培養皿(55 mm)	一つとして	1-8549-02	ぶどうジュース寒天プレート用
コレクションカップ	ひかり化学
イーストペースト	オリエンタルドライイースト 東京
グレープジュース100%	ウェルチフード株式会社
幼虫の飼育
スモールバイアル(12ml、40×23.5 mm、PS)	ザルシュテット	58.487
使い捨てループ	一つとして	6-488-01
スタンダードフライフード			レシピはブルーミントンストックセンターのウェブサイトにあります。
解剖
解剖顕微鏡	カールツァイス	ステミ2000-C
解剖顕微鏡	ライカ	S8 AP0
組織培養皿(35 x 10 mm、未処理)	いわき	〒1000-035
シルガード	東レ		皿内のシリコンの石炭
テルモ針(27G、0.40×19mm)	テルモ	NN-2719Sの	ティッシュを切る「ナイフ」
鉗子、イノックス、#5	Dumont, スイス
昆虫ピン(直径0.18mm)	滋賀ブランド		フィレット解剖用
マイクロハサミ	夏目製作所	MB-50-10
固定
純水	メルクミリポア
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
ホルムアルデヒド	ナカライ・テスク	16222-65
パラホルムアルデヒド	ナカライ・テスク	02890から45
トリトン-X100	ナカライ・テスク	35501から15
マイクロチューブ(1.5ml)	イナオプチカ	CF-0150
潜伏
スウィストミキサーTM-300(ロッカー)1台として	一つとして	TM-300	ロッカー
ウシ血清アルブミン	シグマ	9048-46-8
一次抗体
アンチSRO(モルモット)、1:1000
抗GFP(ウサギ)、1:1000	分子プローブ	A6455 (英語)	島田丹羽あんたち丹羽, 2014
抗GFP(マウスmAb、GF200)、1:100	ナカライテスク	04363-66
アンチ5HT(ウサギ)、1:500	シグマ	S5545
anti-Hts 1B1 (マウス)	Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)	1B1
抗DE-カドヘリン(ラット)、1:20	DSHBの	DCAD2
アンチNC82(マウス)、1:50	DSHBの	NC82
二次抗体
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート	ライフテクノロジー	A-11008
ヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 488コンジュゲート	ライフテクノロジー	A-11001
ヤギ抗ラットIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 546コンジュゲート	ライフテクノロジー	A-11081
ヤギ抗モルモットIgG(H+L)二次抗体、Alexa Fluor 555コンジュゲート	ライフテクノロジー	A-21435
Alexa Fluor 546色素結合ファロイジン	ライフテクノロジー	A-22283
マウント試薬
マイクロスライドガラス	松波ガラス工業(株)	SS7213
正方形の顕微鏡カバーガラス	松波ガラス工業(株)	C218181
FluorSave試薬(マウンティング試薬)	カルバイオケム	345789
トランスファーピペット 1 ml (使い捨てスポイト)	ワトソン	5660-222-1S
フライストック
w;GMR45C06-GAL4			ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#46260)
UAS-GFPです。UAS–mCD8::GFP			東京大学の伊藤和彦さんからの贈り物です。
w[1118]
w; ファントム-GAL4#22/UAS-turboRFP
w;UAS-mCD8::GFP;TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) および Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w;UAS-mCD8::GFPの			ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#32188)
yw;; nSyb-GAL4			ブルーミントンショウジョウバエストックセンターから。(#51941)