局所熱プローブアッセイ:ショウジョウバエ幼虫の高温の侵害受容を評価する方法

要約

出典:Chattopadhyay, A., et al. ショウジョウバエの幼虫における熱侵害受容の評価方法。J. Vis. Exp.(2012年)。

ショウジョウバエの幼虫は、専用の感覚ニューロン(侵害受容器)を持っており、その反応が潜在的に有害な熱刺激に対する反応が、動物に嫌悪的、またはいわゆる「侵害的」行動を引き起こします。このビデオでは、キューティクルに熱プローブを局所的に適用した場合の幼虫の行動を記録することにより、熱侵害受容を評価する方法について説明します。したがって、この方法は局所熱プローブアッセイと呼ばれます。

プロトコル

このプロトコルは、Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012)からの抜粋です。

1. 局所熱プローブアッセイ

Pro-Dev Engineeringが製造した特注のサーマルプローブを使用して、個々の幼虫の体節に有害な熱刺激を照射します(材料の表を参照)。このプローブには最適な設計上の特徴(~.07 mm²の面積の小さな金属チップと、23 °Cから65 °Cの設定温度を正確に維持する能力)がありますが、原則として、定義された温度まで最大20秒間加熱できる小さなチップを備えたツールで十分です。プローブの先端は、腹部セグメントA4の背側正中線上で初期の3^番目の幼虫を正確に刺激するために使用されます(図1を参照)。この熱刺激に応答して、幼虫は一般に、横方向に360度以上転がる嫌悪的な引きこもり行動を示します。この行動は、一般に自発的な活動に短い一時停止を伴う、無害な室温の金属プローブに対する軽いタッチ反応とは異なります。

熱プローブアッセイのプロトコル:

1. サーマルプローブの温度を希望の設定値に事前設定します。
2. 絵筆または鉗子を使用して、個々の幼虫を平らなプラットフォーム(通常はバインダーから切り取ったビニールの小片を使用します)にそっと移し、その後、幼虫を刺激します。幼虫は、サーマルプローブと接触する前に、水の薄い膜で覆う必要があります。幼虫を覆う水の膜は、ビニールに触れたときに幼虫が乾燥しないようにしながら、できるだけ小さく、幼虫を完全に覆う必要があります。
3. プローブと幼虫の表面との間に約45°の角度で先端を軽く押し付けながら、セグメントA4でプローブ先端を幼虫にそっと押し付けます(図1を参照)。圧力は幼虫の表面にわずかなくぼみを引き起こすはずであり、通常は移動を防ぐのに十分です。幼虫が動き続ける場合は、少し圧力をかけると、通常は停止します。視野を超えて移動する幼虫からのデータを記録しないでください、または応答または20秒のカットオフまで一定のプローブ接触を達成できない幼虫
。
4. 離脱反応が示されるまで、または20秒のカットオフに達するまで、いずれか早い方まで幼虫を刺激し続けます。.反応する幼虫は、通常、最初に頭と尾を持ち上げる予備的な行動を示します。これに続いて、通常、少なくとも360度回転する撤退動作が続きます。360度の完全なロールのみがノシフェンシブな行動として採点されます(予備的なヘッドまたはテールレイズはそうではありません)。
5. 引き出し動作が開始されたら、プローブとの接触を解除し、引き出しまでの遅延または時間を記録します。20秒以内に離脱行動が観察されない場合、幼虫はノンレスポンダーです。レスポンダーはさらに2つのカテゴリに分類できます。離脱行動が5秒以内に示された場合、幼虫はファストレスポンダーです。離脱行動が5〜20秒の間に示された場合、幼虫はスローレスポンダーです(Babcock et al., Curr. Biolの図1を参照)。(2009年))。

結果

図1:局所熱プローブアッセイの実験セットアップ。熱プローブは、プローブの温度を設定および維持するために使用される熱制御ユニットによって制御されます。プローブは前後軸に対して垂直に保持され、水平に対して45°の角度で幼虫を刺激するために使用されます。プローブの接触は、図のように腹部セグメントA4で特別に行われます。ユーザーは、20秒のカットオフまで、またはローリング動作が始まるまで、この接触を穏やかな圧力で維持する必要があります。温度が有害であると認識されると、幼虫は少なくとも1回の360°ロールを特徴とする嫌悪的な離脱行動を示します。ロールの数は、1つまたは複数にすることができます(図2Bを参照)。この図の拡大版を表示するには、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
サーマルプローブ	Pro-Devエンジニアリング	オンデマンドでカスタムビルド	連絡先情報はリクエストに応じて提供できます
ライカ DFC290 12V/400mA カラーカメラ	ライカマイクロシステムズ	12730080	同等のカメラなら何でもかまいません。
ライカ MZ6 顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	MZ6ズーム本体(光学系キャリア)の品番は10445614
Schott Ace Modulamp ユニット	ショットAG	A20500(エー20500
ショットデュアルグースネック23インチ光ファイバーライトガイド	ショットAG	ショットA08575
サーマルコントロールユニット	TSCI株式会社	カスタムビルド	詳細はご要望に応じて提供できます
ツァイスステミ2000顕微鏡	カールツァイス株式会社	NT55-605	同等の顕微鏡であれば何でもかまいません。
鉗子	ファインサイエンスツール	FS-1670
絵筆	ブリックアートマテリアル	06762-1002
35 X 10 mmポリスチレンシャーレ	ファルコンBD	351008	代替料理のテストは行っておりません。
ビニール片	オフィスデポ	480009

)