温度勾配アッセイ:ショウジョウバエの幼虫の温度選好性を試験する方法

要約

出典:Liu, J., et al. ショウジョウバエの幼虫の熱的選好を決定するための温度勾配アッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

ショウジョウバエは温度の小さな変化を区別できるため、好ましい温度条件の環境を選択できます。このビデオでは、ショウジョウバエの幼虫の温度選好を線形の温度勾配でテストする行動アッセイについて説明します。

プロトコル

このプロトコルはLiuらからの抜粋です。A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2018).

1. 温度勾配の設定

1. 一方向のグラデーションを準備する
   1. アッセイ中に湿度の高い周囲環境を作り出すには、2つのウォーターバスに接続された2つのアルミニウムブロックを、10 cm離して濡れたペーパータオルの上に置きます(図1A)。
   2. アッセイを開始する~2時間前に2つのウォーターバスをオンにして、アルミニウムブロックの温度が平衡化するのに十分な時間を確保します。
      注:模擬実験を実施して、目的の線形温度勾配を達成するために必要な各ウォーターバスの温度を決定することをお勧めします。ウォーターバスを設定するための一般的な温度ペアを表1に示します。ただし、表面温度は周囲温度の影響を受けることに注意してください。チューブの長さも、チューブ内で冷却が行われるため、温度に影響します。私たちのセットアップのチューブの長さは1.5mです。
   3. 1%アガロース100 mLを高出力設定で500 mLの丸型広口ボトルに電子レンジで加熱し、25 mL/アッセイプレートを水平なベンチトップに注ぎます。アルミニウムブロックに同時に配置できる2つのアッセイプレートを準備します（図1A)。
   4. アガロースが固まった後(10〜20分)、標準的なキッチンスポンジまたはメラミンスポンジで各アガロース表面を優しくこすり、アガロース表面をわずかに粗くすると、アガロースゲルに水を噴霧すると、滑らかで薄い水膜が形成され、水滴が形成されなくなります。
   5. プレートが乾燥するのを防ぐために、アッセイを実行する準備ができるまで、プレートを蒸留水を入れた容器にプレートを完全に浸します。
2. 双方向のグラデーションを準備する(オプション)
   1. アッセイ中に湿度の高い周囲環境を作り出すには、濡れたペーパータオルの上に3つのアルミニウムブロックを8cm離して置きます(図1B)。
   2. アッセイを開始する~2時間前に2つのウォーターバスをオンにして、アルミニウムブロックの温度が平衡化するのに十分な時間を確保します。
      注:双方向勾配の各ウォーターバスの温度を決定するために、模擬実験を行うことをお勧めします。ウォーターバスを設定するための一般的な温度ペアを表2に示します。ただし、表面温度は周囲温度の影響を受けることに注意してください。チューブの長さも、チューブ内で冷却が行われるため、温度に影響します。私たちのセットアップのチューブの長さは1.5mです。
   3. アガロースがプレートからこぼれ落ちるのを防ぐために、アルミニウムプレートの端をラベリングテープで包み、高さ10mmの壁を形成します(図1B)。
   4. ハイパワー設定を使用して、500 mLの丸型広口ボトルに200 mLの1%アガロースをマイクロ波で注入し、120 mLをアッセイプレートに注ぎます。
   5. アガロースが固まった後(~30分)、一般的なキッチンスポンジまたはメラミンスポンジで各アガロース表面を優しくこすり、アガロース表面を少し粗くすると、アガロースゲルに水を噴霧すると、滑らかで薄い水膜が形成され、水滴が形成されなくなります。
   6. アッセイプレートが乾燥するのを防ぐために、アッセイを実行する準備ができるまで、蒸留水を入れた容器にアッセイプレートを完全に浸します。
3. 一方向のグラデーションを設定する
   1. グラジエントアッセイ装置の隣のベンチで試薬とアイテムを準備します(材料の表を参照)。
   2. 効率的な温度移動を促進するために、アルミニウムブロックとアッセイプレートの間の隙間を埋めるために、ブロックとプレートの間の界面に水を噴霧します。
   3. 手袋を使用して、アッセイプレートを水容器から取り出します。アガロースゲルとプレートの間に水が侵入し、表面に隆起が生じた場合は、P1000マイクロピペットで水を取り除
   いてください。
   4. アッセイプレートをアルミニウムブロックの上に置き、どちらかの端から2cmの境界がアルミニウムブロックの端と正確に一致するようにします（図1A,C)。
   5. プレートの表面(アガロース表面を覆う薄い水膜で十分です)に水を噴霧して、アガロースゲルが乾燥するのを防ぎます。幼虫が水滴に閉じ込められる可能性があるため、水膜が連続していて水滴がないことを確認してください。
   6. グラジエントシステムを段ボール箱で覆うと、水の蒸発が減り、ゲル表面の温度が安定します。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。
   7. プレート上の12ポイントで表面温度を確認します(図1C)。各ゾーン内で 2 つの計測を行い、ゾーン内に変動性があるかどうかを確認します。両方のスポットの温度が目的の温度から±0.2°C以内であることを確認してください.
      注:ゾーン内の変動性は、通常、アルミニウムブロックの端までの2つのスポットの正確な距離が同一でないために発生します。アルミニウムブロック上のプレートの位置を調整して、いずれかの端から2 cmの境界がアルミニウムブロックの端と正確に一致することを確認します。
   8. 測定された温度勾配が目的の勾配から逸脱している場合は、ウォーターバスの温度設定を増減し、ウォーターバスの温度が安定した後に表面温度を再確認してください。
   9. アッセイを開始するまで、グラジエントシステムを段ボール箱で覆います。
4. 双方向グラデーションを設定する(オプション)
   1. グラジエントアッセイ装置の隣のベンチで試薬とアイテムを準備します(材料の表を参照)。
   2. 3つのアルミニウムブロックの表面に水を噴霧し、表面間の隙間を埋めることで、アルミニウムブロックからアッセイプレートへの効率的な温度移動を促進します。
   3. アッセイプレートを水容器から慎重に取り出し、アルミニウムブロックの上に置きます。アガロースゲルとプレートの間に水が侵入し、表面に隆起が生じる可能性がある場合は、P1000マイクロピペットで水を取り除きます。
   4. アッセイプレートをアルミニウムブロックの上に置き、どちらかの端からの最初と最後のゾーンの正中線が2つの側面のアルミニウムブロックの端と正確に一致するようにします（図1、B、D)。
   5. プレートの表面(アガロース表面を覆う薄い水膜で十分です)に水を噴霧して、アガロースゲルが乾燥するのを防ぎます。幼虫が水滴に閉じ込められる可能性があるため、水膜が連続していて水滴がないことを確認してください。
   6. グラジエントシステムを段ボール箱で覆うと、水の蒸発が減り、ゲル表面の温度が安定します。温度が平衡化するまで5〜10分待ちます。
   7. 10 個のゾーンのそれぞれの正中線に沿った 2 点で表面温度を確認します (図 1D)。各ゾーン内で 2 つの計測を行い、ゾーン内に変動性があるかどうかを確認します。両方のスポットの温度が目的の温度から±0.2°C以内であることを確認してください.
      注:ゾーン内の変動性は、通常、アルミニウムブロックの端までの2つのスポットの正確な距離が同一でないために発生します。アルミニウムブロック上のプレートの位置を調整して、各エッジに最も近い最初と最後のゾーンの正中線が2つの側面のアルミニウムブロックのエッジと正確に一致することを確認します。
   8. 測定された温度勾配が目的の勾配から逸脱している場合は、ウォーターバスの温度設定を調整し、ウォーターバスの温度が安定した後に表面温度を再確認してください。
   9. アッセイが始まるまで、ブロックを段ボール箱で覆います。

2. アッセイと計算

1. 段ボール箱を取り出し、幼虫をプレートに移す直前にゲル表面温度を確認してください。温度平衡が乱れないように、段ボール箱が開いている時間を最小限に抑えてください。表面が乾燥している場合は、表面に少量の水をスプレーします。
2. 150±50匹の幼虫を各プレートの中心近く(6つのゾーンのうちゾーン3と4の間)に分配し、一方向の勾配(リリースゾーン;図 1C).
   注:双方向の勾配の場合、各半分の中央ゾーンに沿って200〜400匹の幼虫を分布させます(図1D)。
3. 各アッセイプレートにマイクロプレートの蓋をかぶせて、幼虫が這い出るのを防ぎます。アガロースゲルでの幼虫の選択に影響を与える可能性のある光への曝露を防ぐために、セットアップを段ボール箱で覆います
   注:双方向勾配の場合、プレートが大きく、幼虫の好ましい温度が中央ゾーンにあるため、プレートを蓋で覆う必要はありません。その結果、端に蓄積し、這い出す機会を持つ幼虫はほとんどいません。
4. 幼虫の年齢に応じて、一方向グラジエントの場合は10〜30分、双方向グラジエントの場合は15〜35分間、アッセイを進行させます(表3)。
5. 段ボール箱とマイクロプレートの蓋を取り外します。デジタルカメラを使用してプレートを上から撮影します。各アッセイプレートの写真を2枚撮影し、研究者がコントラストと輝度の高いものを選択して分析できるようにします。
6. アッセイプレートからすべての幼虫を取り除き、吸引によってプレートの外側の任意の場所を取り除きます。
7. アッセイプレート、チューブ、および細胞ストレーナーを蒸留水で完全に洗浄します。その日に調製したアッセイプレートは、アガロースの表面が損傷しない限り再利用してください。
8. 各ゾーンの幼虫の分布の割合を計算します。
   1. アッセイ結果の写真画像を開くには、画像にマーキングを追加できる任意のソフトウェアを使用します。アッセイゾーンを示すには、アッセイプレートの境界に基づいて2cmごとに垂直線を引きます。
   2. 各ゾーンの幼虫の数を数え、その数を記録します。どの壁からも0.5cmの領域で幼虫を数えないでください。ゲルは壁の近くで厚くなり、これらの領域では表面温度は線形ではありません。
   3. 一方向の勾配の場合、各ゾーンの分布の割合を次のように計算します。
      (特定の2cmゾーンの幼虫の数)/(6つのゾーンの幼虫の総数)×100。
   4. 双方向勾配の場合、各ゾーンのパーセンテージ分布を次のように計算します:
      (特定の2cmゾーンの幼虫の数)/(勾配の両側の5つのゾーンの幼虫の総数)x 100。

結果

図1:単一および双方向のグラジエントアッセイのセットアップ。(A)2つのアルミニウムブロックに2つのアルミニウムアッセイプレートを使用した一方向グラジエントセットアップ。アルミブロックの温度は、2つのウォーターバスからの循環水によって制御されます。(B)3つのアルミニウムブロック、ウォーターバス、および双方向勾配のためのアルミニウムプレート(250 x 220 mm)の配置。左右のブロックは同じウォーターバスに接続され、中央のブロックは他のウォーターバスに接続されています。アルミニウムアッセイプレートをテープで包み、10 mmの壁を形成して1%アガロースを封じ込めます。(C)プレート上の温度をチェックし、幼虫を放流する位置(ドットで示されています)。実験を開始する前に、各ゾーン内の2つのポイントで温度を確認し、目的の線形温度勾配が確立さ...

材料

<テーブル fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> この記事で使用された材料の一覧 名前 会社 カタログ番号 コメント グラジエントアッセイ装置 PolyScience 9106、冷蔵/加熱6L循環バス トーマス・サイエンティフィック 9106 このモデルは販売終了しています。更新された交換モデルには、120 V、60 Hz用の1186R00および1197U04、または240 V、50Hz用の1184L08および1197U04が含まれます。 アルミアッセイプレート(一方向グラジエント用) 外寸:14 x 10.1 x 0.9 cm、内寸:12.9 x 8.7 x 0.8 cm、黒アルマイト。 アルミ板(双方向勾配用) 25 x 22 x 0.2 cm、黒アルマイト。 アルミブロック 外形寸法:25.5 x 5 x 1.4 cm、内部チャネルのパラメータを図1Dに示します。 アルミブロック・チューブ用コネクター マクマスター・カー 91355K82の タイゴンサニタリーシリコンチューブ タイゴン 57296の 1/4 "ID×3/8"OD x 1/16"壁 名前 会社 カタログ番号 コメント アッセイ用アイテムと試薬 杵 USAサイエンティフィック 17361 1.5 mL微量遠心チューブ用乳棒 温度計 紛れ当たり 51II. 熱電対 紛れ当たり Kタイプ ユニバーサルマイクロプレートリッド コーニング 6980A77の 35mmディッシュ コーニング 9380D40の ラベリングテープ(双方向グラデーション用) フィッシャーサイエンティフィック 15〜951 フィッシャーブランドラベリングテープ 2インチ x 14ヤード アガロース インビトゲン 16500500 1%溶液を調製します 蔗糖 シグマ S0389-5KGシリーズ アッセイ開始直前に18%溶液を調製 ペイントブラシ フィッシャーサイエンティフィック 11860年 50 mL遠心チューブ デンビル C1062-P スクープーラ フィッシャーサイエンティフィック 14-357Q 500mL 丸広口ボトル パイレックス 1395-500 セルストレーナー(300mm細孔) プルリセレクト 43-50300 幼虫洗浄のオプションアイテム 段ボール箱(バイアルトレイ) ジェネシー・サイエンティフィック FS32-124