ショウジョウバエ活動量モニター(DAM):ハエの自発運動を測定する方法

要約

出典:Chiu, J. C., et al. ショウジョウバエの概日リズムと睡眠パラメータを研究するための自発運動活動の評価.J. Vis. Exp.(2010年)。

このビデオでは、自発運動を追跡するために使用されるショウジョウバエ活動モニタ(DAM)システムについて説明しています。研究者は、DAMから収集した活動データを使用して、ショウジョウバエの概日リズムを研究しています。注目のプロトコルクリップは、デバイスにハエをロードし、概日実験のための活動データを記録する方法を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Chiu et al., Assay Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2010年)。

1. 活動チューブへのハエの装填と自発運動モニタリングシステム

1. ハエをアクティビティチューブに入れる前に、アクティビティモニターを収納するために使用されるインキュベーターの電源を入れます。インキュベーターコントロールを使用して温度を調整し、DAMシステムライトコントローラーを使用して明暗領域を設定するか、インキュベーター独自の光制御システムを目的の実験デザインに従って設定します。フライをアクティビティチューブに装填するのに必要な時間は、温度が安定するのに十分であるべきです。
2. ハエに二酸化炭素を麻酔します。
3. 細い絵筆を使って、1匹のハエをアクティビティチューブに優しく移します。
4. 細い鉗子で約半インチの1本の糸の中央をつかみ、その糸をアクティビティチューブの非食品端に挿入して開口部を塞ぎ、実験中にハエが逃げるのを防ぐと同時に、チューブへの空気の流れを可能にします。あるいは、小さな穴の開いたプラスチックキャップ(Trikinetics, Inc.)を使用して開口部を閉じることもできます。
5. ハエが目覚めるまでチューブが横向きに置かれていることを確認してください、そうしないとハエが食べ物にくっつく危険性があります。
6. チューブをアクティビティモニターに挿入します。Trikineticsモニターの新しい、よりコンパクトなモデル(Trikinetics DAM2およびDAM2-7)では、赤外線ビームが中央位置でチューブを通過するように、チューブを輪ゴムで所定の位置に保持する必要があります。
7. アクティビティモニターをインキュベーターに入れ、電話線を介してデータ収集システムに接続します。DAM System収集ソフトウェアを使用して、すべてのモニターが適切に接続されていること、および各モニターからデータが収集されていることを確認してください。モニターは、各ガラス活動管の中央に赤外線ビームを放射します。ハエの自発運動活動は生のバイナリデータとして記録され、赤外線ビームが壊れるたびに「1」が記録されるか、赤外線ビームが壊れない「ゼロ」が記録されます。

2. 概日周期と振幅を決定するためのデータ記録のための実験計画

法

1. ハエは、目的の明暗(LD)および温度レジームに丸2〜5日間さらすことにより、同期および同伴されます。最も一般的に使用される同調条件は、25°Cで12時間明かり/12時間暗(12:12 LD)の明暗サイクルです。この一般的に受け入れられている標準的な条件は、基本的にショウジョウバエがアフロ赤道の場所に由来するという考えに基づいています。概日リズムを研究するとき、慣れ親しむ必要のあるいくつかの言い回しがあります。このプロトコルに関連して、インキュベーター内の照明が点灯する時間はツァイトゲバー時間0(ZT0)と定義され、他のすべての時間はその値に相対的です(例えば、12:12 LDサイクルでは、ZT12は照明が消灯される時間です)。標準的な12:12 LD条件下では、野生型のDrosophila melanogasterは通常、2回の活動を示します。1つは「朝」ピークと呼ばれるZT0を中心とし、もう1つは「夕方」ピークと呼ばれるZT12を中心とします(図1A)。朝と夕方の発作は内生時計によって制御されていますが、光/闇の遷移に反応して活動が一過性に爆発する「驚愕」反応もあります。2日間の同調は最小であり、たとえば、より時間がかかり、一定の暗闇でのフリーランニング期間を測定することを目的とした大画面で使用できます(以下のステップ2を参照)。ただし、毎日の明暗サイクル中の活動パターンを研究することに興味がある場合は、より多くのデータを取得するために、ハエをLDで4〜5日間維持することが望ましいです。基本的に、最終データ分析でハエの数またはLD日数を増やすと(たとえば、LD自発運動活動の過去2日分のプールデータ)、より信頼性の高い日周活動プロファイルと測定値(たとえば、朝または夕方のピークのタイミング)が生成されます。さらに、活動の日次分布は、日長(日長)と気温の関数として変化します。日長または温度を標準から変更する主な理由は、毎日の活動パターンが季節的適応をどのように受けるかを研究したい場合です(例:Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. ショウジョウバエは、毎日の温度サイクルにも同調することができます(例:Glaser and Stanewsky、Curr Biol.(2005);Sehadova et al., Neuron (2009))。わずか2〜3°Cしか変化しない温度サイクルは、活動リズムを同調させるのに十分です。
2. 自走自走運動リズムは、同調期間が終了した後、一定の暗所および温度条件下で測定されます(上記のステップ1を参照)。光周期の設定は、LDの最終日の暗期のいつでも変更でき、実験の翌日がDDの初日を表すようにすることができます。ハエの概日周期と振幅(リズムのパワーや強さなど)を計算するには、7日間のDDデータ収集で十分です。一般に、特定の遺伝子型の信頼性の高い自由走行期間を得るためには、少なくとも16匹のハエのサンプルサイズが必要です。日周活動の測定にのみ関心がある場合でも、内因性期間の変化はLDの活動の日次分布を変える可能性があるため、DDでハエの自由走行期間を測定するのが最善です。例えば、内因性の周期が長いハエは、通常、LDで夕方のピークが遅れます(例えば、図2)を参照)。
3. 実験の終了時に、DAM Systemソフトウェアを使用して収集された生のバイナリデータが、USBキーなどのポータブルデータストレージデバイスにダウンロードされます。
4. 生のバイナリデータは、DAM Filescan102X(Trikinetics, Inc.)を使用して処理され、概日パラメータの分析時には15分と30分のビンに、睡眠/休息パラメータの分析時には1分から5分のビンに合計されます。現在、ショウジョウバエの睡眠/休息の標準的な定義は、連続して5分間の無活動です(Hendricks et al.、Neuron(2000);Ho and Sehgal, Methods Enzymol., (2005))。
5. DAMシステムで収集されたデータを分析するにはさまざまな方法がありますが、ここでは、ラボで日常的に使用されている方法のみを提供します。Microsoft Excelは、遺伝子型を異なるサンプルグループに割り当てるために使用されます。FaasXソフトウェア(M. Boudinot and F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, France)またはInsomniac(Matlabベースのプログラム;Leslie Ashmore、ペンシルベニア州ピッツバーグ大学)は、概日(例:期間とパワー)または睡眠/休息(例:睡眠率、平均安静時間)パラメーターをそれぞれ調べるために使用されます。

結果

図1:FaasXを使用して生成された誘導グラフは、リズミカルな野生型ハエ(per+導入遺伝子を持つ^ハエ0匹あたりw)(AおよびB)と⁰変異体あたりの不整脈w(CおよびD)の毎日の自発運動活動リズムを示しています。オスのハエを25°Cに保ち、12:12 LD(明暗)サイクルで4日間同調させ、続いてDD(一定の暗闇)で7日間同調させた。各ハエ系統について、個々のハエ(n>32)の自発運動活動レベルを15分ビンで測定し、次いで平均化してその系統を代表するグループプロファイルを得た。AとCは明暗サイクル(LD 2-3)の2日目と3日目を平均して得られた活動データ、BとDは2日目と3日目を一定の暗闇(DD 2-3)で平均して得られた活動データです。縦棒は、明るい期間 (明るい灰色) または暗い期間 (濃い灰色) に 15 分間のビンに記録されたアクティビティ (...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ショウジョウバエ活動モニター(DAM)	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム	DAM2 または DAM5	DAM2モニターはよりコンパクトで、1つのインキュベーターに収まるものが多い
電源インターフェースユニット(DAMシステム用)	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム	PSIU9	PS9-1 AC電源付属
ライトコントローラー	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム	LC6
パイレックスガラス管	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム	PGT5、PGT7、および PGT10
プラスチック製アクティビティチューブキャップ	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム	キャップ5	プラスチックキャップの代わりに糸を使用できます。
DAM Systemデータ収集ソフトウェア	トライキネティクス株式会社;マサチューセッツ州ウォルサム		MacとPCの両方で利用できるバージョン
FaasXソフトウェア	国立科学研究センター		Macのみ
Insomniac 2.0ソフトウェア	ピッツバーグ大学医学部		Matlabで実行されます。PCとMacintoshの両方で使用できます。
温度と日周制御を備えた環境インキュベーター(例:パーシバルインキュベーター	パーシバルサイエンティフィック株式会社	I-30BLLの	内部空間の寸法:幅:65cm;身長:86cm;奥行き:55cm
温度および日周制御を備えた環境インキュベーター、例:概日時限照明と時限温度を備えたDigiTherm加熱/冷却インキュベーター	株式会社トライテックリサーチ	05DT2CIRC001	内部空間寸法:幅:36m;高さ:56メートル;奥行き:28cm
APC Smart-UPS 2200VA 120V(非常用電源バックアップユニット)	APCの	SU2200NET	出力電力容量:1600ワット
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S7903
バクト寒天	BDバイオサイエンス	214010
TissuePrep パラフィンペレット	フィッシャーサイエンティフィック	T565	融点:56°C-57°C
ブロックヒーター	VWRインターナショナル	㒒12621-014

の の )