$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、de Vries and Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. からの抜粋です。(2013年)。
1. チャネルロドプシンハエを生成する
- クロスUAS-ChR2は、お好みのGal4ドライバーで飛行し、視葉のFoma-1ニューロンで発現するG105-Gal4を使用します。
- 青色光刺激に対する視覚的な反応の可能性を排除するために、両方のハエのラインはw + norpAの背景にあります。
- 最終結果: w+norpA;G105-GAL4/UAS-ChR2 +
- 成虫のハエが近づいた後、選択した雌を生鮮食品に置き、10 μMの全トランスレチナール(ChR2に必要な補因子)を補給し、光から保護することで、行動アッセイを実施する前に3日間行います。
2. 10 μM All-trans-retinal Enhanced Foodを作る
- 100 mgのオールトランスレチナールを17.6 mlの95%エタノールに溶解して、20 mMレチナールを作ります。.すべてのトランスレチナールを常に光から保護してください。
- 標準的なコーンミールフライフードを電子レンジで溶かし、温かくなるまで冷まします。
- 50 μLの20 mM all-trans-retinalを10 mLのフライフードのバイアルに混ぜます。
- バイアルを冷まし、光から保護してください。
3. 装備
- ピペットチップ:標準の1,000μlピペットチップをチップの近くで切断し、細孔径~2.25mmにします。
- プラットフォーム (図 1) を参照)。
- デルリンベースは、17 cm X 25 cmで、各コーナーにネジ穴が開いて、1/4インチNPTクーラントホースコネクタに適合します。
- デルリン製の垂直ホルダーがベースの中央に取り付けられています。全体の寸法は25mm×40mm×65mm(幅×奥行き×高さ)です。幅10mmの溝がホルダーの長さに沿って走り、下部につまみネジが付いています。ホルダーの上部には、25 mm X 40 mm X 10 mmのプラットフォームが取り付けられており、直径3.5 mmの穴がホルダーの溝に揃っています。
- LED アレイ (図 1) を参照)。
- ~18cmの長さのクーラントホースの4本のアームが、クーラントホースコネクタを使用してプラットフォームベースに取り付けられています。クーラントホースは構造的な支持体としてのみ使用され、冷却目的では使用されません。
- 適切な間隔で溝が各アームのクーラントホースの最後の部分に切り込まれ、各アームの端にヒートシンクが取り付けられます。
- 青色LEDのRebel Tri-Starsは、事前にカットされた熱接着テープを使用して各ヒートシンクに取り付けられています。Carclo 18°トライレンズは、各Tri-Starに取り付けられています。
- LED Tri-Starsは、指定どおりにBuckPuck DCドライバーと電源に配線されています。私たちは、各BuckPuckが2つのTri-Starを直列に駆動するようにセットアップを手配しました。
- 4つのLEDトライスターすべてを700mAで照らしたところ、当社のプラットフォームでは713 W/m2の放射照度が得られました。
- カメラ:カメラは小さな三脚に取り付けられ、プラットフォームの上部に焦点を合わせます。
4. ビヘイビアアッセイ
- 氷の上のハエに短時間麻酔をかけます。
- 個々のフライをピペットチップにセットし、テープを使用してチップの両端を閉じます。
- ハエが目を覚まし、ピペットの先端を積極的に探索した後、テープをはがし、垂直ホルダーの溝にピペットを置きます。つまみネジは、ピペットチップを所定の位置に固定し、チップの底を閉じるために使用されます。
- フライがピペットチップを探索するとき(通常は30〜60秒)、フライがチップからプラットフォームに出てくる直前にカメラ録画を開始します。
- フライがプラットフォームに現れたら、1〜2秒待ってから、青色のLEDをオンにします。タイマーを使用して、フライが飛行を開始するまでの時間を手動で測定します。
