ショウジョウバエの心臓の準備:成虫のハエの心臓生理学を研究する技術

要約

出典:Vogler、G.、Ocorr、K.ショウジョウバエの鼓動する心臓を視覚化します。J. Vis. Exp.(2009年)。

このビデオは、ハエの成虫の心臓、またはショウジョウバエの背側血管と呼ばれるものについて説明しています。注目のプロトコルは、生きた心臓の準備のための解剖手順を示しています。

プロトコル

このプロトコルは、Vogler and Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009)からの抜粋です。

1. 始める前に

1. 108mM Na ⁺、5mM K +、2mM Ca^{2 +}、8mM MgCl₂、1mM NaH₂PO₄、4mM NaHCO₃、10mMスクロース、5mMトレハロース、5mM HEPES(pH 7.1、シグマケミカルズのすべての試薬)を含む人工血リンパ(AH)溶液を新たに調製します。スクロースとトレハロースは、細菌汚染を防ぐために、使用直前に冷蔵ストック溶液からAHに追加する必要があります。
2. AHを室温に戻し、少なくとも15分間空気を泡立てて溶液を酸素化します。
3. 脂肪の除去に必要ないくつかの細い毛細血管(ガラス毛細血管、100ul、VWRなど)を引っ張ります。

2. 成虫のハエからの半無傷のショウジョウバエの心臓

1. 成虫のショウジョウバエは、Fly Nap(Carolina Biological Supply Co.)で2〜5分間麻酔されます。フライナップにハエを長時間放置しないように注意する必要があります。ハエに麻酔をかけるためにも、短期間の寒さへの曝露が用いられますが、CO₂は心拍数やリズミカルな影響が長く続くため、推奨されません。
2. 麻酔をかけたハエを、背側を下にして、ワセリンの薄い層でコーティングされたペトリ皿に入れます。翼と体の疎水性キューティクルは可逆的にゼリーに「くっついて」いますが、フライは必要に応じて再配置できます。これは、その後の操作で特に重要になります。
3. 最初のカットは、湾曲したスプリングハサミ(Roboz #5611)を使用して行われます。ハサミの刃は脚の下に配置され、首の近くの胸部の背側表面に向かって角度が付けられています。頭部、腹側神経索、脚を一回切り傷で切除します。次に、調製物を酸素化人工血リンパ(AH)溶液に浸します。
4. スプリングハサミを使用して、腹部の後端(腹部セグメント7と8で構成)を1回のカットで取り除きます。これにより、腹部の両端に沿って横方向の切り込みを入れることができ、後腸と腹部のキューティクルとの間の接続を切断するのに役立ちます。次に、腹側腹部のキューティクルの解放されたフラップが除去されます。
5. ステップ3と4では、腸の前部と後部の接続が切断されるため、腹部の臓器は気管によってのみ所定の位置に保持されます。腸やその他の腹部臓器は通常、宝石商の鉗子(Roboz、#55)と優しく引っ張ることを使用して、単一の塊として除去できます。内臓を摘出すると、太った体に囲まれた背側のキューティクルにまだ取り付けられている心臓管が現れます。
6. 脂肪体は光学顕微鏡では非常に不透明であるため、心臓管をはっきりと見るためには、この脂肪の一部を取り除く必要があることがよくあります。これは、細かく引き抜かれたガラス毛細血管を使用した脂肪吸引技術によって達成されます。キャピラリーは、標準的なピペットプーラー(Sutter P-97ピペットプーラーなど)を使用して作成され、真空源に取り付けられたプラスチックチューブ(Tygon、1/16インチ)に挿入されます。このシステムは、心臓管の周りから余分な脂肪を吸引するために使用されます。吸引力はチップの直径に比例するため、チップの直径が40ミクロンを超えるピペットは使用しないでください。心臓自体に触れないように細心の注意を払う必要があり、心臓の後部は非常に壊れやすいため、その領域は完全に避ける必要があります。
7. 成虫のショウジョウバエの心臓管が露出し、鼓動しているはずです。必要に応じて、キューティクルをワセリンからそっと持ち上げ、慎重にタンピングして戻すことで、キューティクルと付着した心臓の位置を変えることができます。この時点で、調製物を浸漬する溶液を新鮮なAHLと交換する必要があります。この調製物は、操作の前に酸素化で20〜30分間平衡化させる必要があります。調製物を60分以上維持する場合は、新鮮なAHLで灌流する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロ解剖スプリングハサミ(湾曲)	ロボズ外科用器具株式会社	RS-5611	グロスカットに適しています(ステップ2)
マイクロ解剖スプリングハサミ(ストレート)	ロボズ外科用器具株式会社	RS-5620
デュモン#55鉗子	ファインサイエンスツール	11295から51
デュモン#5鉗子	ファインサイエンスツール	11295から10
ガラスキャピラリー、細かい	サイエンス製品	GB100T8P
ピペットプーラー	サッター機器	P-97	水平ピペットプーラーと垂直ピペットプーラーの両方が機能します
プラスチックチューブ	タイゴン	1/16インチ内径	100μLのキャピラリー用
ヒストアクリル®組織接着剤	B.ブラウンメディカル