ショウジョウバエ産卵選好アッセイ:ハエの意思決定をテストする方法

要約

出典:Gou, B., et al. 個々のショウジョウバエの産卵選好性を調べるためのハイスループットアッセイ。J. Vis. Exp.(2016年)。

ショウジョウバエの雌は、基質の中から選択し、産卵に魅力的な場所を選択します。このビデオでは、産卵選好アッセイと呼ばれる、彼らの意思決定をテストする行動アッセイについて説明しています。注目のクリップでは、カスタムメイドのセットアップで手順を実演しており、研究者は同時に多くの女性の行動をテストできるだけでなく、ビデオ録画やオプトジェネティックセットアップにも対応しています。

プロトコル

このプロトコルは、Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016)からの抜粋です。

1. チャンバーの構築、組み立て、アッセイのセットアップ

1. 機械工場にアクリル製の産卵室(図1A-D)を作ってもらいます。さまざまな部品のエンジニアリング図面を補足図1-3に示します。高解像度の写真もここにあります(http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf)。
2. 図 1 C に示すように、プラスチックシートをチャンバーのローディング (上部) ピースに挿入します。これは、ハエを個々の産卵アリーナに積み込む際の底面として機能します。
3. CO₂パッドでメスに麻酔をかけ、各産卵アリーナに個別にロードします。ハエが_CO2から回復し、新しい環境に順応するまで~30分かかります。
4. アガロース基質を準備します。
   1. 便宜上、溶かした1%アガロースの既製のボトルを55°Cのウォーターバスに保管してください。
   2. 50 mLのコニカルチューブに希望量のスクロース原液(2 M)を加え、適量のアガロースと混合します。例えば、150 mMのスクロース基質を調製するには、750 μlの2 Mスクロース溶液をチューブに入れ、チューブにアガロースを10 mLのマークまで充填します。
   3. 同じ方法でプレーン基板を準備しますが、ショ糖溶液の代わりに蒸留水を追加します.
      注:このプロトコルにおけるアガロースの最終濃度は1%未満です。私たちの経験では、アガロースの正確な濃度は、アガロースの正確な濃度が0.9 - 1.1%以内に制御され、2つの基質が同じアガロース濃度である限り、重要ではありません。
5. チャンバーの基質 (底面) 片を取り、図 1 Dに示すように、1,000 μl のアガロース基質を各トラフにピペットで入れます。
6. アガロースを~30分間固化させます。
7. アガロース基質とフライの準備ができたら、産卵チャンバーの3つのピースすべてを組み立ててから、プラスチックシートを取り出します。
8. チャンバーをフライインキュベーターに入れます.
   注:産卵実験の長さは、実験の必要性によって異なります。通常、実験はO/N(14〜16時間)で実行します。また、概日リズムのタイミングが産卵選好に及ぼす有意な影響は観察されなかった。
9. チャンバーにCO₂を注入することにより、女性に麻酔をかけます。チャンバーを分解し、麻酔をかけたハエをハエの死体安置所(つまり、コーン油で満たされた空のコーヒー缶)に捨てます。記録管理のために、結果の写真を撮ります (図 2) を参照)。
10. 卵の数を手動で数え、分析のために選好指数を計算します。選好指数を (N_a - N_b)/(N_a + N_b) として計算します (N_a と N_{b は}、それぞれサイト a とサイト b の卵の数を表します)。

結果

図1:産卵室と産卵プロトコル。(A)完全に組み立てられた産卵室。(B)分解された部品。A:ローディングピース(上)、B:仕切りピース(中央)、C:基板(下)ピース。これらの部品の設計図を補足図1-3に示します。(C)チャンバーのローディングピース。A':引き戸、A":レール。プラスチックシートは、装填されたフライを所定の位置に保持するための床として機能するために、装填ピースに挿入されます。通常、プラスチックシートの端にカラーテープを貼ります(赤い矢印)。(D)チャンバーの基板(下部)とディバイダー(中央)の部分。アガロースは個々のトラフに堆積して、産卵基質として機能します(矢印)。四辺形は、1匹のハエの産卵アリーナの輪郭を描いています。(E

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウルトラピュアアガロース	インビトゲン	16500-500
蔗糖	シグマ	S0389
ウォーターバス	漁夫	15-462-6Q
産卵室	カスタムビルド
フライバイアル(ナロー)	ジェネシー	紀元前32-116年