C.エレガンス割球解剖:卵殻を取り出して胚細胞を解離する方法

要約

出典:Hsu, C. R., et al.単離された線虫Caenorhabditis elegans胚割球および接着性ポリスチレンビーズによる空間的細胞接触パターンのin vitro再構成。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオでは、初期胚からC.エレガンス割球を単離する方法を紹介しています。得られた細胞は、細胞培養やex vivo実験に適しています。

プロトコル

このプロトコルは、Hsu et al, 単離された線虫胚割球と接着性ポリスチレンビーズによる空間的細胞接触パターンのIn Vitro再構成からの抜粋です。(2019年)。

1. 胚割球の単離
2. 手袋と白衣を着用して、漂白液との切断や接触を避けてください。
   1. マイクロキャピラリー(容量;10μL)の両端を右手と左手で持ちます。
   2. マイクロキャピラリーを両端に向かって引っ張って張力をかけ、キャピラリーの中心をバーナーの上に持ってきて、手で引っ張る2つのキャピラリーを作成します(図1A)。
   3. 手で引っ張った毛細血管の先端を解剖顕微鏡で鉗子で切り取り、引っ張った毛細血管をマウスピペッティング装置に取り付けます。ピペットは2種類ご用意ください。ピペットの先端開口部のサイズは、胚移植と卵殻除去のために、それぞれC.エレガンス胚の短軸の長さ(30μm)の約2倍と1倍である必要があります(図1B-D)。
   4. 45 μLの卵塩溶液をマルチウェルスライドのウェルにピペットで移します(図2A、下)。
   5. 5〜10匹の成虫のC.エレガンスを卵塩溶液を含むウェルに置きます。
   6. 初期のC.エレガンスの胚を取得するには、C.エレガンスの体の左右に2本の針を配置し、針を互いにスライドさせて成虫を細かく切ります(図2A;上図)。
   7. 45 μLの次亜塩素酸塩溶液を、卵塩溶液を含むウェルの隣のウェルにピペットで移します(図2B)。
   8. シェルトンの増殖培地45μLを、次亜塩素酸塩溶液を含むウェルの隣の後続の3つのウェルにピペットで移します(図2B)。
   9. 1細胞期および初期2細胞期の胚を次亜塩素酸塩溶液に移植します。これは、手描きのキャピラリーによるピペッティングにより、胚移植用です(図2B)。
   10. 40〜55秒待ちます。
   11. 次亜塩素酸塩溶液からシェルトン増殖培地に胚を移し、手描きのキャピラリーでピペッティングして胚移植を行い、胚を洗浄します(図2B)。
   12. 胚移植用の手描きキャピラリーでピペッティングして、胚をシェルトン増殖培地の新しいウェルに移すことにより、胚を再度洗浄します(図2B)。
   13. 洗浄した胚をシェルトン増殖培地の新しいウェルに移し、手描きのキャピラリーでピペッティングして胚移植を行います。卵殻を取り外すために手描きのキャピラリーを使用して、ピペッティングを慎重に繰り返します(図2C;中央の概略図)。卵殻がうまく除去されると、胚細胞はより球形になります(図2C;右)。
   14. 卵殻除去のために、手描きの毛細血管で穏やかかつ連続的にピペッティングすることにより、2細胞期の胚性割球を分離します(図2D)。

図1:割球の単離。(A)ガラスキャピラリーの引っ張り。(B)胚移植用の手描きガラスキャピラリー。(C)卵殻除去用の手描きガラスキャピラリー。(D)卵殻除去のための毛細血管開口部の適切なサイズを示す模式図。矢印は胚を示しています。スケールバーは100μmを示しています。

図2:割球単離ワークフロー。(A)胚を得るための卵塩緩衝液中の成虫C.エレガンスの解剖。写真は、卵殻除去前の2細胞期および4細胞期の胚を示しています。(B)次亜塩素酸塩の処理と洗浄。(C)概略図は、卵殻の除去の適切なタイミングを示しています。写真は卵殻除去後の4細胞期胚です。(D)割球の分離。写真は分離した2細胞期の胚を示しています。CとDの矢印のサイズは、ピペッティング中に必要な相対的な力を示しています。スケールバーは50μmを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アスピレーターチューブアセンブリ	ドラモンド	21-180-13	割球単離用。
Caenorhabditis elegans strains:N2、野生型	カエノーラブディティス遺伝学センター	N2	この研究で使用したひずみ
Caenorhabditis elegans strains:KSG5、遺伝子型:zuIs45;itIs37	社内で	KSG5	この研究で使用したひずみ
キャリブレーション済みミルコピペット、10 μL	ドラモンド	21勝180敗13	割球単離用
CDリピッドコンセントレート	ライフテクノロジー	11905031	割球分離用。組織培養フードで作業します。
クロロックス	クロロックス	N.A.(ナウエイト)	割球分離用。次亜塩素酸塩処理がうまく機能しない場合は、新しいボトルを開けてください。
カバースリップホルダー	社内	N.A.	割球分離用。
解剖顕微鏡:Zeiss Stemi 508、Mスタンド付き。光源はLED内蔵。接眼レンズの倍率は10倍です。	カールツァイス	ステミ508	割球分離用。
ウシ胎児血清、適格ワンショット、カナダ原産	ギブコ	A3160701	割球分離用。組織培養フードで作業します。
一般使用および精密グライド皮下注射針、25ゲージ	BDの	14-826AA	割球単離用
イヌリン	アルファ・アエサル	AAA1842509	割球単離用
MEMビタミン液(100x)	ギブコ	11120052	割球分離用。
マルチテストスライド10ウェル	MPバイオメディカル	ICN6041805	割球単離用
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	ギブコ	15140148	割球分離用。
ポリビニルピロリドン	フィッシャーバイオ試薬	BP431-100	割球単離用
塩化カリウム	バイオショップ	POC888	割球単離用
シュナイダーのショウジョウバエ滅菌ミディアム	ギブコ	21720024	割球分離用。組織培養フードで作業します。
塩化ナトリウム	バイオショップ	SOD001	割球単離用
水酸化ナトリウム溶液、10 N	フィッシャーケミカル	SS255-1	割球単離用
シリンジフィルター、PTFE、非滅菌	バシックス	13100115	割球分離用。
Tygon S3 ラボ用チューブ、配合 E-3603、内径 3.175 mm	サンゴバン・パフォーマンス・プラスチックス	89403-862	割球分離用。
Tygon S3 ラボ用チューブ、配合 E-3603、内径 6.35 mm	サンゴバン・パフォーマンス・プラスチックス	89403-854	割球分離用。

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