C.エレガンス走化性アッセイ:線虫の化学感覚を試験する方法

出典:Campbell, J. C., et al.A Caenorhabditis elegans 栄養状態に基づく銅嫌悪アッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオでは、線虫C.エレガンスの走化性を紹介し、硫酸銅に対する走化性回避をテストするサンプルプロトコルを示しています。

以下のプロトコルは、Campbell et al, A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Based Copper Aversion Assay, J. Vis. Exp. (2017)からの抜粋です。

実験生物の調製
1. アッセイ開始の24時間前に、株ごとに10個のL4段階線虫を選択して、テスト時に生物が若年成人であることを確認します。試験した変異体またはコントロール線虫ごとに、10個のL4(コントロールに10個、アッセイに10個)を選択します。
  1. OP50 Escherichia coliを播種した標準的な寒天プレート上で、標準的な方法を使用してL4生物を24時間維持します。その後の洗浄ステップで生物が失われた場合は、開始サンプルサイズを増やして補います(つまり、10個ではなく20個のワームを選びます)
    注:行動は本質的に可変的な表現型です。3つの別々の日に各株について3回で方法を実行します。ディスカッションセクションで強調されているように、新規株に対する追加の制御株と条件を含めます。
2. アッセイの直前に、実験生物を細菌のない寒天プレートに移し、線虫を1分間自由に動かして余分な細菌を除去します。
  1. アッセイの24時間前に実験生物が汚染状態を経験した場合は、それらを廃棄してください。
3. 1 mLのM9を無菌プレートにピペットで移し、線虫を微量遠心チューブに洗浄します。
4. 3,000 x gで1分間遠心分離し、チューブの底にワームがペレットを形成するはずです。ウォームペレットを乱さずにM9溶液を吸引します。1 mLのM9をワームペレットに加え、チューブを反転させてワームを溶液と混合します。
5. 手順 1.4 をさらに 3 回繰り返します。
  1. 過剰な細菌が最初に線虫と一緒に移された場合は、合計5回繰り返します。バクテリアを銅製のフードレースプレートに移してはいけません。アッセイプレートに食品が移されると、正確なデータ収集に支障を
6. 最終洗浄後、上清を100μLのM9まで吸引し、ワームペレットが残ります
  注意:飢餓関連の行動は、30分後に明らかになります。したがって、洗浄ステップが完了したら、ワームを直ちに溶液から移送する必要があります。
アッセイプレートの調製
1. アッセイの2日前に、標準的なNGM寒天プレートを調製します。
  1. プレートを湿気の多い環境に保管する場合は、アッセイの3日前に寒天プレートを作成してください。あるいは、プレートの蓋を3〜6時間取り外して、適切な乾燥を確保します(無菌環境の場合)。
2. 太い油性マーカーを使用して、プレートの下側に外縁に沿って線を引いて、もう1本を線を引いて正中線のバリアを形成します(図1)。正中線バリアは、プレートの各エッジから等距離にある必要があります。定規を使用して、正確な測定を確保します。これらのラインは、バクテリアと銅溶液を移す際のガイドとして機能します。大腸菌が銅溶液の前に転写される場合、これらの線は指標として機能します。
3. 銅バリアの片側のみに50μLのOP50大腸菌を入れたシードプレートを敷き詰めて、均一な芝生を作ります(図2)。細菌濃度はアッセイ間で一貫している必要があります。ただし、濃度のわずかな違いに応じて、ばらつきはほとんど観察されていません。
  1. プレートの下側にあるマークされた線を使用して、バクテリアが銅溶液に接触しないようにします。銅溶液がプレートの端を裏打ちし、正中線の障壁を形成する場合は、銅溶液が食物源と接触しないように細菌を移動させます。
4. プレートの2番目のセットに印を付け、OP50大腸菌をそれらに移さないでください(図2)。これらのプレートは、ネガティブコントロールの評価に役立ちます。これらのプレートには、プレートの半分に最初の転写原点を示すためのマーキングも必要です。
5. バクテリアを乾燥させてから、プレートを37°Cで一晩インキュベートします。37°Cのインキュベーターまたは部屋に移す際に、細菌パッチが邪魔されないようにしてください。過度の乱れは、フードパッチの位置や形状を変える可能性があります。
走化性アッセイ
1. アッセイ開始前に、0.5 Mの硫酸銅(II)溶液を新たに調製してください。プレートあたり125 μLの溶液を使用する場合は、使用するアッセイプレートの数に応じてこの容量をスケールアップします(例:アッセイプレート5枚、625 μL)。
2. 寒天の端に硫酸銅(II)溶液100μLをピペットで固定し、外側の銅バリアを作成します。プレートのマークされた下側は、ガイドとして機能する必要があります。
3. 硫酸銅(II)溶液25μLをピペットで注入し、正中線バリアを作成します。
  1. 硫酸銅(II)溶液が細菌パッチに接触しないようにしてください。スポッティングテクニックを使用すると、寒天のくぼみ/引っかき傷によりストリーキングが移動に影響を与える可能性があるためです。
4. 銅溶液をプレート上で乾かします。期間は、プレートやラボの状況によって異なります。移載後5分ごとに乾燥具合を目視で確認します.
  注:銅溶液は青みがかった色合いを示し、簡単に識別できます。実験用ティッシュを使用して、プレートの端付近で溶液を軽くたたき、乾燥具合を確認します。
5. チューブの底から20 μLのワームペレットをアッセイプレートのバクテリアフリー半分にピペットで移します。
  1. 10匹の線虫がアッセイプレートに移されたことを確認します。誤って余分なワームが含まれていた場合は、ハロカーボンオイルで摘み取って取り除き、プレートにバクテリアが追加されないようにします。各アッセイは、アッセイ中に一貫した数の線虫を持つべきである.
    注:アッセイ中に転送される線虫が少なすぎる場合は、初期サンプルサイズを大きくすると、洗浄および転送中の潜在的な損失を軽減できます。
6. 実験用ティッシュペーパーでプレートから余分なM9を取り除きます。M9は硫酸銅(II)溶液と接触してはいけません.
  注意:この手順を実行する間、ワームと寒天表面が影響を受けないようにしてください。過度に使用すると、実験組織がプレートの寒天表面にくぼみを作り、ワームを取り除く可能性があります。KimWipe で誤って削除したワームは破棄する必要があります。
7. M9溶液が除去され、すべての線虫が非液体運動パターンを開始したら、アッセイストップウォッチを開始します。
  1. 最適には、M9溶液を1分以内に除去します。重要なパラメータは、正弦波の移動の識別です。線虫は、液体中では正弦波ではなくスラッシングするなど、異なる方法で移動します。各実験生物がスラッシングを停止したら、アッセイストップウォッチを開始します。
8. アッセイプレートを30分ごとにチェックします。
  1. 細菌パッチ付きのアッセイプレートでは、生物が4時間にわたって食品パッチに到達した場合、生物に陽性のスコアを付けます。ネガティブコントロールプレートの場合、生物がバリアを通過した場合は、陽性のスコアを付けます。

figure-results-1
図1:5cmのペトリ皿の下側にある銅溶液の配置を示すマーキングの視覚的表現。 これらの適応症は、プレートの切片が適切に測定されていることを確認するために使用され、細菌パッチと銅溶液を寒天表面に移す際のガイドラインとして機能します。

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図2:5cmのペトリ皿は、オンとオフのフードアッセイプレート用に2つのセクションに分かれており、オンフードプレート用のこれらのセクションの1つの中央に細菌の芝生が形成されています。食品パッチは、プレートの端を覆い、正中線バリアを形成する試験化合物と接触してはなりません。

名前	会社	カタログ番号	コメント
M9溶液[3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、H2Oを1リットルに。使用前に滅菌するためのオートクレーブ。			ラボで作成
硫酸第二銅	シグマ	C-1297	水を使用して、0.5Mの濃度に適切に懸濁

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