出典:Turek, M. et al.Caenorhabditis elegansの長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー。J. Vis. Exp.(2015年)。
このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形されたアガロースウェルに含まれる線虫のタイムラプスイメージングのプロトコル例が含まれています。
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方法論記事
カルシウムイメージング:生きたC.エレガンスの神経活動を可視化する方法
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2023年4月30日
この記事について
要約
プロトコル
このプロトコルは、Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015)からの抜粋です。
1. カルシウムイメージング
- HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3'UTR, unc-119(+)])など、遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現するトランスジェニック株を使用してください。
- 広視野落射蛍光用に装備された複合顕微鏡を使用してください。EMCCDカメラのTTL出力をLEDのTTL入力に接続すると、カメラがフレームを記録するたびにサンプルが照らされます。露光時間は約5ミリ秒です。EMゲインは50〜300の範囲で使用します。
- 各線虫を15〜30分ごとに撮影し、まずDICで20秒間、次にGFP蛍光で20秒間、GCaMPを記録するために24時間実行しているバースト動画を指定し、その後、mKate2シグナルの最終画像を撮影して発現レベルを制御します。各バースト中に 2/秒のフレーム レートを使用します。
- 目視データ検査では、疑似カラーマップを使用して、蛍光強度の小さな変化の視認性を高めます。蛍光データをΔF/Fとしてプロットし、Fを蛍光の平均ベースライン値とします。カルシウムデータ分析の詳細な説明は、文献に記載されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| LEDシステム | クールLED | pE-2 | |
| 複合顕微鏡 | ニコン | 結ぶ | |
| EMCCDカメラ | アンドール | iXon 897 (英語 | iXon Ultra 897として販売開始 |
| 顕微鏡用Zステージ | 事前 | ナノスキャンZ | |
| X-Yステージ | 事前 | プロスキャンIII. | |
| 赤色光フィルター | 彩度 | ET660/50メートル | |
| 35 mm シャーレ | 隼 | ファルコンディスポーザブルシャーレ、滅菌、コーニング |
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