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Abstract

出典:Turek, M. et al.Caenorhabditis elegansの長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー。J. Vis. Exp.(2015年)。

このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形されたアガロースウェルに含まれる線虫のタイムラプスイメージングのプロトコル例が含まれています。

Protocol

このプロトコルは、Turek et al, Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015)からの抜粋です。

1. カルシウムイメージング

1. HBR16(goeIs5[pnmr-1::SL1-GCaMP3.35-SL2::unc-54-3’UTR, unc-119(+)])など、遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現するトランスジェニック株を使用してください。
2. 広視野落射蛍光用に装備された複合顕微鏡を使用してください。EMCCDカメラのTTL出力をLEDのTTL入力に接続すると、カメラがフレームを記録するたびにサンプルが照らされます。露光時間は約5ミリ秒です。EMゲインは50〜300の範囲で使用します。
3. 各線虫を15〜30分ごとに撮影し、まずDICで20秒間、次にGFP蛍光で20秒間、GCaMPを記録するために24時間実行しているバースト動画を指定し、その後、mKate2シグナルの最終画像を撮影して発現レベルを制御します。各バースト中に 2/秒のフレーム レートを使用します。
4. 目視データ検査では、疑似カラーマップを使用して、蛍光強度の小さな変化の視認性を高めます。蛍光データをΔF/Fとしてプロットし、Fを蛍光の平均ベースライン値とします。カルシウムデータ分析の詳細な説明は、文献に記載されています。

Materials

LED system	CoolLED	pE-2
Compound microscope	Nikon	TiE
EMCCD camera	Andor	iXon 897	now sold as iXon Ultra 897
Z-stage for the microscope	Prior	Nano Scan Z
X-Y stage for the microscope	Prior	Proscan III
Red light filter	Chroma	ET660/50m
35 mm Petri dish	Falcon	Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning