方法論記事

C. elegans筋面積測定:横紋筋の形態を定量化するための標準化された方法

2023年4月30日

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Teoh, J. S. et al.線虫の細胞構造と細胞小器官の形態を研究するための定量的アプローチ。J. Vis. Exp.(2019年)。

>C. elegansには、単一筋節と多発性筋節の2種類の筋肉、または横紋筋があります。このビデオでは、線虫の移動に関与する横紋体壁筋の配置について説明し、画像解析ソフトウェアを使用して筋肉の形態を測定するためのサンプルプロトコルが含まれています。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、Teoh et al, Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。

1. 体壁の筋肉構造の定量化

  1. 体壁筋構造の蛍光イメージング
    1. 導入遺伝子stEx30(Pmyo-3::gfp::myo-3 + rol-6(su1006))を保有する株(RW1596など)を取得し、ミオシン繊維をGFP.
      で標識します。 注:動物への導入遺伝子の導入は、目的の系統をすでに導入遺伝子を発現している動物と交配するか、またはDNAを生殖腺の遠位腕にマイクロインジェクションすることによって達成できます。この導入遺伝子のrol-6変異によって誘発される「ローリング」表現型は、筋肉の視覚化を促進します。体壁の筋肉は、通常、外側の1つに横たわっているため、野生型の動物では通常は見えない背側と腹側に沿って走っています。rol-6(su1006)対立遺伝子は動物のねじれを誘発し、それによりイメージングのために一部の筋肉細胞を露出させます。
    2. 蛍光顕微鏡と高解像度の荷電結合デバイスカメラ(CCD)、40倍以上の対物レンズ、GFPフィルター、および取得ソフトウェアを組み合わせて、動物を画像化します。
    3. 露光時間と照明強度を調整して、画像の飽和を防ぎます。
    4. 少なくとも1つの完全に見える斜めの筋肉細胞を含む動物のセクションから筋肉の画像(400倍倍)をキャプチャして保存します。単一の筋肉細胞が不完全である領域や焦点が合っていないセクションは避けてください。また、極端な前後の領域、および外陰部に隣接する領域からの画像も除外します.
      注:動物に目に見える完全な筋肉細胞が1つもない場合は、カバーガラスをそっとスライドさせて動物を回転させ、完全な細胞を露出させます。
  2. 筋細胞面積の測定
    1. フィジーのソフトウェアでイメージを開きます(この調査ではバージョン2.0.0を使用しました)。
    2. ポリゴン選択を使用して、1 つの斜めの筋肉セルの周囲を慎重にトレースします。アンカードットをドラッグして端のポリゴンの線を調整し、トレースを改善します。
    3. ソフトウェアの上部にある[分析]タブに移動し、[測定]をクリックして、選択の領域を計算します。面積とその他の測定値を含む別の結果テーブルが表示されます。面積測定値が結果テーブルに表示されない場合は、[分析]タブの[測定値の設定]に移動し、面積ボックスにチェックが入っていることを確認します。同様に、不要な他の測定値のチェックを外します。
    4. 縮退した領域や欠落した領域を持つ筋肉細胞の場合は、ポリゴン選択ツールで欠落している領域をトレースし、再度[測定]をクリックします。セル内に複数のギャップがある場合は、各ギャップを個別にトレースします。
    5. 単一の筋肉細胞全体に対するギャップ面積の比率を計算します。比率が高いほど、細胞内の大きなギャップによる筋肉の変性が進んでいることを示します。野生型動物によく見られるように、欠落している領域がない場合、比率は 0.
      として計算されます。 注:コントロールとして、筋肉構造の欠陥についても視覚的に採点し、結果を定量的測定と比較します。これは、菌株が研究室で初めて研究される場合に特に役立ちます。表現型スコアリングについては、フィラメントの完全性に基づいて動物を欠陥があるか不良でないかを評価します。例えば、明確なフィラメント縞模様の喪失、GFP凝集、または構造破壊による筋肉細胞内の隙間がある動物は、欠陥としてスコアリングされます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
共焦点顕微鏡ライカTCS SP8反転プラットフォーム
蛍光顕微鏡カールツァイスAGツァイス アクシオ イメージャー M2
ガラスカバースリップ#1サーモサイエンティフィックMENCS22221GP
ガラスカバースリップ #1.5ツァイス474030-9000-000SCHOTT製
スライドガラスサーモサイエンティフィックMENS41104A/40

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FijiGFP

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