$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
このプロトコルは、Le et al, Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019)からの抜粋です。
- 緑膿菌を与えられたC.エレガンスの腸内透過性に対する化学物質(DIM)の影響をテストするためのNGMプレートの調製
- 500 mLのガラス瓶(NGM寒天)に、0.5 gのペプトン、0.6 gのNaCl、195 mLの蒸留水、マグネチックスターラー、および6.8 gの寒天を加えます。
- ペプトン0.5 g、NaCl 0.6 g、蒸留水195 mL、寒天なしマグネチックスターラーを、別の500 mLガラス瓶(NGMブロス)に加えます。
- 2本のボトル(ステップ1.1〜1.2)、空の100 mLガラス瓶1本、および空の500 mLガラス瓶1本を121°Cで15分間オートクレーブします。次に、ボトル入り培地をウォーターバスで55°Cまで30分間冷却します。寒天培地を水浴に入れ、次のステップのためにブロス(ステップ1.2から)の入ったボトルを取り出します。
- 0.4 mLの1 M CaCl2、0.4 mLのコレステロールをエタノール(mL)、0.4 mLの1 M MgSO4、1 M KPO4を10 mLの添加物化学品をNGMブロスに加えます(エタノール中のコレステロールを除いて、これらの成分はすべて滅菌する必要があります)。次に、マグネチックスターラーで55°Cで混合物を完全に攪拌します。
- オートクレーブ処理した空の 500 mL ガラスボトルにジメチルスルホキシド(DMSO)を、オートクレーブ処理した空の 100 mL ガラスボトルに DIN をラベル付けします。
- 50 mLのNGMブロスをDIMラベルの付いた100 mLボトルに移します。20 mM DIMストック500 μLをボトルに加え、よく混ぜます
注:DIMはDMSO(20 mM DIMストック)に溶解します。
- NGM寒天培地をウォーターバスからすばやく取り出し、DIMラベルのボトルにNGM寒天培地50 mLを加えて十分に混合します。
- DIM含有NGM培地20 mLのアリコートを各90 mm x 15 mmシャーレに入れます。このステップから、約5枚のDIM含有NGMプレートを作製できます.
注:各NGMプレートのDIMの最終濃度は100μMになります。
- DMSO含有NGMプレートを調製するには、150 mLのNGMブロスをDMSO標識500 mLボトルに移します。ボトルにDMSO1.5mLを加え、よく混ぜます。
- NGM寒天培地150mLをDMSOラベルボトルに加え、よく混ぜます。
- 20 mL の DMSO 含有 NGM 培地を 90 mm x 15 mm の各シャーレに入れます。このステップから約15枚のDMSO含有NGMプレートを作製できます.
注:各NGMプレート中のDMSOの最終濃度は0.5%になります。
- プレートを室温で少なくとも3時間固化し、使用するまで4°Cで保存します.
注:プロトコルはここで一時停止できます。
- 大腸菌OP50または緑膿菌PAO1を4°Cの冷蔵庫から取り出し、培養物を適切にボルテックスしてからNGMプレートに広げます。
- 大腸菌OP50または緑膿菌PAO1細菌培養液800μLを各新鮮なNGM寒天プレートに置き、プレートを20°Cのインキュベーターで一晩乾燥させます
注:プロトコルはここで一時停止できます。3回目の実験(図1)では、大腸菌OP50をコーティングしたDMSO含有NGMプレート2枚、緑膿菌PAO1を生溶かしたDMSO含有NGMプレート1枚、緑膿菌PAO1を生溶かしたDIM含有NGMプレート1枚を調製しました。
- 細菌またはDIMおよびFITC-デキストランの摂食の治療
- 年齢同期卵を、生の大腸菌OP50を食物として補充したNGMプレート上で、20°Cで64時間インキュベー
トします。
- 年齢同期したL4幼虫をSバッファーで洗浄し、それら(約500匹以上の線虫)をさまざまな細菌や化学物質を含む処理NGMプレートに移します。20°Cで48時間インキュベートします
注:処理時間は、使用する細菌や化学物質に応じて、24時間から72時間の範囲です。DIMの治療効果または予防効果は、ワームを病原体で前処理してからDIMでワームを治療するか(治療効果)、またはワームをDIMで前処理してから病原体で治療する(予防効果)ことによっても評価できます。
- FITCデキストランを補充したプレートを調製するには、2 mLの熱不活化大腸菌OP50と4 mgのFITCデキストランを混合します。.次に、100 μL の FITC-デキストランと大腸菌 OP50 の混合物を 20 枚の新鮮な NGM 寒天プレート (60 mm x 15 mm) に分け、プレートをクリーンベンチで 1 時間乾燥させます
注:各NGMプレート中のFITC-デキストランの最終濃度は20μg/mLとなります。
- ビヒクル制御治療のために、FITC-デキストランを含まない大腸菌OP50含有NGMプレートを5枚用意します。この目的のために、100 μLの熱不活化大腸菌OP50を各新鮮なNGM寒天プレート(60 mm x 15 mm)に分け、プレートをクリーンベンチで1時間乾燥させます
注:独立した実験ごとに、15枚のFITCデキストラン添加NGMプレートと5枚のFITCデキストラン添加NGMプレートが必要です。
- 48時間の処理後(ステップ2.2から)、Sバッファーでワームを洗浄し、ワームをFITC-デキストラン補充プレートとFITC-デキストランを含まないNGMプレートに移し、プレートを一晩(14〜15時間)インキュベートします
注:各治療群について、FITCデキストラン染色(またはビヒクル制御栄養)の5回の繰り返しが必要です。
- 寄生虫をSバッファーで洗浄し、新鮮なNGM寒天プレートで1時間這う
注:独立した実験ごとに、合計20枚の新鮮なNGMプレートが必要です。このステップでは、大腸菌OP50の有無にかかわらず、または大腸菌OP50を添加したNGMプレートを使用できます。
- 50 μLの4%ホルムアルデヒド溶液を、黒色の96ウェル平底プレートの各ウェルに加えます。各NGMプレートから約50の線虫を各ウェルに移し、蛍光測定を行います。1〜2分後、各ウェルからすべてのホルムアルデヒドを完全に除去し、100μLの封入剤を加えてウェルをコーティングします><。
注:ホルムアルデヒド溶液(4%)は、ワームを固定して固定するために使用されます。各処理群について、5ウェル(5replicate)を画像解析に使用します。
- オペレッタイメージングシステムによる線虫のイメージングとFITC-dextran蛍光取り込み
の測定による腸管透過性の決定
注:蛍光立体顕微鏡法は、オペレッタシステムの代わりに画像解析に使用できます。
- オペレッタのハイコンテントイメージングシステムを使用して蛍光画像を取得し、蛍光強度を測定し、ハーモニーソフトウェアで画像を分析します。
- Harmonyソフトウェアで、アイコン[蓋を開く]を押して蓋を開き、プレートを機械に入れます。
- パラメータを設定します。
- [セットアップ]をクリックし、プレートタイプ(96ウェルコーニングフラットボトム)を選択し、チャネル(明視野チャネルとEGFPチャネル)を追加します。
- レイアウトを調整します。[レイアウト]選択に移動し、[トラック]を選択してパラメーターを調整します(最初の画像は1μm、平面数は10、距離は1μm)。
- 処理ウェルの 1 つとキャプチャ フィールドを 1 つ選択し、[テスト] を押して、[実験の実行] セクションの写真が問題ないかどうかを確認します。
- 画像に問題がなければ、[セットアップ]セクションに戻り、画面の端にある[リセット]アイコンを押します。次に、すべてのターゲットウェルと適切な数のキャプチャフィールドを選択します。
- 再度「Run experiment」に進み、プレート名を入力してから、「Start」を押して処理を開始します。
- 蛍光の強度を測定するには、画像解析セクションに移動して画像を入力します。共通しきい値を0.5に、面積を>200μm2に、分割係数を3.0に、個々のしきい値を0.18に、コントラストを0.18に調整します。次に、強度プロパティを計算し、平均を出力として選択します。[適用]アイコンを押して、設定を保存します。
- [評価] セクションに移動し、ヒートマップとデータ テーブルを取得して強度を測定します。Readout パラメーターを Cells — Intensity Cell EGFP Mean — Mean per Well に設定し、評価を開始します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。
- オペレッタからデータを抽出するには、設定ボタンをクリックしてデータ管理を選択します。
- [アーカイブの書き込み] を選択し、参照を開いてファイルを選択します。
- ファイルを選択するには、左隅にある小さな + 信号をクリックし、[測定] をクリックして [プレート名] を選択します。
- ファイルを選択し、[OK]をクリックします。
- ファイルを保存するパスを選択するには、アクティブなパスで [参照] シグナルをクリックします。
- [開始] をクリックしてデータ ファイルを保存します。
注:プロトコルはここで一時停止できます。
- C. elegansのFITC-デキストラン蛍光の統計的解析
- データをインポートし、統計ソフトウェアを使用して平均と標準偏差(SD)を計算します。
- 一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して、有意差を分析します。
