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次のプロトコルは、Farboudらからの抜粋です、Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp.(2018年)。
1. RNPアセンブリ
- 実験を事前に十分に設計し、すべてのRNA、DNA、およびタンパク質成分を事前に取得します。最初のパスとして、表1にリストされているポジティブコントロールのいずれかを試し、材料表に記載されている市販の試薬を使用して、信頼性の高い実験デザインと材料の完全性を確保します。新しいゲノム編集実験の計画に関するその他のヒントについては、このトピックに関する論文を参照してください。
注:後続の手順で説明するように組み立てると、事前に準備されたRNPは-80°Cで保存できます。
- どの遺伝子を標的にするかを選択したら、無料のオンラインツールのいずれかを使用して、最適なgRNAを設計します。ノックアウトを生成することを望む場合は、必ずエクソンをターゲットにしてください.
注:これらのツールは、隣接する化膿性ブドウ球菌PAM配列、高品質スコア、および低いオフターゲットスコアを持つターゲット部位を特定するのに役立ちます。
- S. pyogenes Cas9タンパク質を公表された方法で精製するか、商業ベンダーから購入してください。
- 20 mM の HEPES pH 7.5、150 mM の KCl、10% グリセロール、および 1 mM の TCEP を含む RNA 希釈、RNP 調製、およびタンパク質保存用の一般的な Cas9 バッファーを調製します。分解を防ぐためにRNAを再懸濁または希釈するために使用されるバッファーには、常にヌクレアーゼフリーの水を使用してください。
- ガイドRNA(tracrRNAおよびcrRNAまたはsgRNA)は、公開された方法を使用してin vitro転写を通じて作製するか、核酸合成会社から購入します。
- 遺伝子を挿入する場合は、ドナーDNAテンプレートを合成または購入してください。
- タンパク質とRNAアリコートを-80°Cで保存し、使用直前に氷上で解凍してください
注:凍結融解のたびに効率がわずかに低下します。Cas9精製およびsgRNAのin vitro転写に関する詳細なオープンアクセスプロトコールは、他の場所で入手できます。
- C.エレガンス編集のためのRNP調製:最終容量20μLを作成するために、次の試薬を追加してRNP複合体を組み立てます（最終濃度は括弧内に記載されています：Cas9(2μM)、HEPES pH 7.5(10μM)、KCl(115μM)、crRNA(12μM)、tracrRNA(40μM)、 必要に応じて修復テンプレート(0.5 μM ssDNAまたは最大350 ng/μL dsDNA)。
注:Cas9を介したDSBテンプレート修復の効率は、dsDNA修復構造の濃度に比例します。したがって、リペア テンプレートの濃度が高いほど、テンプレート化されたリペアの効率が高くなります。しかし、350 ng/μLを超えるdsDNAを含むミックスを注入すると、注入された線虫の生存率が低下することが示されています。したがって、混合物中のdsDNAは350 ng/μL以下で使用するのが最善であり、致死性を最小限に抑えながら修復効率を最大化します。
- co-CRISPR/co-conversionスクリーニングアプローチの必要に応じて、複数のcrRNAを添加して複数の遺伝子座を同時に標的とします。crRNAを1つ以上添加する場合は、それぞれをマスターミックスに順次添加してください
注:各crRNAの量は同じである必要はなく、Cas9の濃度を変更せずにマスターミックス中のcrRNAの総濃度を2倍にしても、特定の遺伝子座での突然変異誘発の頻度を妨げるようには見えません。例はPaixらで詳細に説明されています。
- ピペッティングで混合し、RNP溶液を16,000 x gで5秒間遠心して、溶液がチューブの底に集まるようにします。
- 溶液を37°Cで15mインキュベートします。
- サンプルを16,000 x gで1分間遠心分離し、細い穴のマイクロインジェクション針を詰まらせる可能性のある微粒子をペレット化します。後続の手順で上清を使用します。
- C.エレガンスの準備
1. マイクロインジェクションの1日前:マイクロインジェクション用のアガロースパッドを準備します。
ア- ガロースを水に加え、ホットプレートまたは電子レンジで溶液を沸騰させることにより、水中で3%(w / v)アガロース溶液を作ります。
- 24 mm x 50 mm x 1.5 mmのカバーガラススライドをテーブルに並べ、ガラスパスツールピペットを使用して、スライド上にアガロース溶液を少量(~15 μL)滴下します。別のカバースリップを上に置いて、アガロースドロップをすばやく平らにします。アガロースが固まるのを待ってから、カバースリップの1つをはがします。
- アガロースでコーティングされたカバースリップを表向きにして卓上に一晩置いて乾かします。24時間後、アガロースパッドを清潔で乾燥した容器に保管します><。
注:これらは無期限に使用できます。
2. マイクロインジェクションの針を引く: フィラメント (外径 1.0 mm、内径 0.58 mm) のホウケイ酸ガラス キャピラリーを使用して、Mello と Fire57 およびその他のリソースに基づいて針を引っ張ります。針はすぐに使用することも、粘土製の支持体で支えた清潔で乾燥した容器に保管することもできます。
3. 線虫のメンテナンスのために、ペトリプレートに注ぎ、OP50バクテリアでスポットした線虫増殖培地(NGM)寒天を準備します(標準的なC.エレガンスのメンテナンスに関するプロトコルと成長培地のレシピについては、Stiernagleを参照してください)。
4. マイクロインジェクション用の線虫をステージングします:マイクロインジェクションの12-24時間前に、L4ステージの雌雄同体をOP50バクテリアを含む新しいNG寒天プレートに選択し、20°Cで一晩インキュベートします。Cas9ターゲット/インジェクションミックスごとに、~30個のワームをプレートにピッキングします。
- マイクロインジェクションの日:引っ張ったマイクロインジェクション針に、ステップ1.2で準備したRNP溶液上清をロードします。
- ステップ1.2.4の上清を引っ張ったキャピラリーピペットにピペットで移し、キャピラリーピペットから調製したマイクロインジェクションニードルに溶液を埋め戻します(通常、負荷量は0.1μL未満です)。
- マイクロマニピュレータに取り付けられたマイクロインジェクション装置にロードされた針を取り付けます。注入装置の圧力を250kPaに、バランス圧力を25kPaに設定します。
- ロードされた針先を折り返し、鋭い針先を生成します。15 mm x 15 mm x 1.5 mm 角のカバースリップを 24 mm x 50 mm x 1.5 mm のカバースリップの上部に置きます。
- 正方形のカバーガラスの一方の端をハロカーボンオイル700で覆います。
- 針をオイルの15mm角カバースリップの端に配置します。
- 顕微鏡のステージとカバースリップを手でガイドし、注射ペダル/ボタンを押しながら、スライドを針の端に沿って上に磨きます。針先を後ろに折って、針から液体の流れを増やします。注入混合物が針の端に沿って流れ上がり、~1 気泡/秒を形成することにより、最適な流量を達成します。
- マイクロインジェクションの12-24時間前に選別されたL4線虫が、注射当日に発達段階の若年成人であることを確認します。OP50バクテリアが不足しているNG寒天プレートに若い成虫を選び、5分間這い回らせます。これにより、インジェクションパッドに移される細菌の量が減り、針の詰まりが最小限に抑えられます。
- アガロース注入パッド/カバースリップを解剖スコープに置きます。ウォームピックを使用して、パッドの一方の端に沿ってハロカーボンオイルの小さなトラックを置きます。
- オイルでコーティングされたワームピックを使用して、NG寒天プレートからいくつかのワームを持ち上げてオイルのトラックに入れます。まつげや猫のひげなどの細い毛をピペットに取り付けた状態で、ワームを平行に配置し、ワームをアガロースパッドにそっと押し込みます。マイクロインジェクション手順に慣れるまで、一度に1つのワームのみを取り付けて注入します。
注:乾燥したアガロースはワームから水分を吸い上げ、ワームをパッドに付着させます。その結果、ワームが乾燥する可能性があるため、迅速に作業する必要があります。
- 所定の位置に配置されてパッドに取り付けられたら、ワームピックの先端からさらに数滴のハロカーボンオイル(~20 μL)をワームに重ねます。
- C. elegans RNPsによる生殖腺マイクロインジェクションと注射後ケア
マイクロインジェクションプロトコルは、MelloとFireから採用されており、他の場所で詳細に説明されています。
- 取り付けたワームの入ったカバースリップを注射顕微鏡に置きます。低倍率(対物レンズ5倍、接眼レンズ10倍)で、線虫を注射針に対して垂直に配置します。
- 高倍率(対物レンズ40倍、眼球10倍)に切り替え、中期から後期パキテンの核近くの領域に対応する生殖腺腕に隣接する針を再配置します。
- マイクロマニピュレーターを使用して、針をワームに対して動かし、キューティクルをわずかに押し下げます。次に、片手で顕微鏡ステージの側面を軽くたたいて、針をキューティクルに通します。注射ペダル/ボタンを押し、生殖腺アームに注射液をゆっくりと充填し、針を取り外します。.
- もう一方の生殖腺アームでこの手順を繰り返します。
- 線虫が注入されたら、カバースリップ/アガロースパッドを取り外し、解剖顕微鏡の下に置きます。
- 引っ張られたキャピラリーピペットを使用して、M9バッファーをワームにピペッティングすることにより、ワームからオイルを置換します。この処理を行って、ワームを寒天から解放します。
- 10分後、線虫が緩衝液内で動き回っているときに、引っ張ったキャピラリーピペットを使用して、OP50細菌の入ったNG寒天プレートに線虫を移動させます。プレートを20°Cに2〜3時間置き、ワームが回復して動き回るまで待ちます。
- 回収したら、線虫をOP50でNG寒天プレートに個別に移し、プレートを25°Cのインキュベーターに移します。
- P0を注入した線虫を成長させ、子孫を産むのを3日間待ちます。F1の子孫をスクリーニングします。
- co-CRISPRまたはco-conversionを使用する場合は、参照遺伝子の変異表現型を有するかどうかに基づいて、スクリーニング用の候補線虫を選択します。これらのマークされた線虫をOP50を使用して新しいNG寒天プレートに個別に移し、F2子孫を20°Cで産むことができます
注:co-CRISPRスクリーニングまたは選択に使用される表現型は、Cas9編集の成功を早期に推定するはずです。
- co-CRISPR表現型が存在しない場合は、ポジティブコントロールプラスミドをマイクロインジェクションして、マイクロインジェクションの効率を改善します
注:例えば、mCherryタグ付きMYO-2をコードするプラスミドを注入ミックスに含めると、注入効率の評価に役立ちます。pCFJ90の注入に成功した線虫は、蛍光咽頭を持つ子孫を産むことになります。
- F1 ワームを調べて、目的の編集が存在するかどうかを確認します。96ウェルプレートの個々のウェルにF1母体を選び、溶解し、挿入特異的PCR増幅、DNA配列分析、またはサーベイヤーヌクレアーゼアッセイ(CEL-1)のいずれかでDNAを調べます><。
注:これらのアッセイは、co-CRISPR/co-conversionまたはその他のスクリーニングまたは選択レジームを使用して実施できます。
