UV照射:染色体外アレイの統合法

要約

出典:Mariol, M. C et al.A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays with High Transmission Rate into the C. elegans Genome.J. Vis. Exp.(2013年)。

導入遺伝子のマイクロインジェクションは、通常、大きな染色体外アレイを持つC.エレガンス株をもたらし、その結果、導入遺伝子の発現と伝達が変動します。UV照射は、アレイの染色体統合を誘発し、より安定した導入遺伝子伝達を誘発することができます。

プロトコル

このプロトコルはMariol et alからの抜粋です。A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome, J. Vis. Exp.(2013年)。

1. 形質転換線虫の紫外線照射と回収

1. ワーム照射:
   1. 30-100匹の蛍光トランスジェニックL4動物を別々の培養プレートに選んでください(プレートごとに15-20匹)。
   2. 蓋を外した状態でプレートをUV架橋剤に入れます。線虫に0.012J/^cm2を照射します。ひずみは多かれ少なかれUVに敏感であり、結果は使用するUV照射器によって変動する可能性があることに注意してください。0.010-0.015 J/cm²の線量範囲を試験することができます。
2. 照射後のワームの回復:
   1. 放射線を照射したワームをプレートに一晩15°Cで置き、回収します。
   2. 生きている動物の数を確認してください。私たちの手では、約80〜90%の生存率が効率的な照射に適応しています。
   3. 照射した動物を15〜25°Cで育て、子孫が発生段階に達するまで、共注射マーカーの発現を観察できるようにします。

2. 統合型トランスジェニック系統の単離

1. F1動物の選択:
   1. 150-200蛍光F1動物を1匹ずつ別々の培養プレートに保管します。送信率の高い回線(≥80%)には、100匹のF1動物で十分です。
   2. これらのF1プレートは、子孫が蛍光F2動物の観察に適した段階に達するまで、15〜25°Cに保ちます。
   3. i)子孫がいない(F1動物が不妊または死亡したことを示す)、またはii)蛍光性のF2動物が存在しないか、またはほとんどない(F1動物が期待された速度で導入遺伝子を伝達しなかったことを示す)F1プレートをすべて廃棄します。このステップは迅速であり、≥75%の蛍光子孫を示すF1プレートを選択するために蛍光F2線虫の割合を推定する必要がある標準プロトコルと比較すると、真の利点を表しています(表1)。
2. F2動物の選択:
   1. 選択した各F1プレートから4匹の蛍光トランスジェニックF2動物を1匹。蛍光導入遺伝子(mCherry、gfp、dsRedなど)を使用する場合は、蛍光レベルが高いF2線虫を選択してください。これは、これらの動物が統合アレイに対してホモ接合体であることを示している可能性があるためです。F2動物を選別する際には、次のステップで偽陰性を避けるために、卵や幼虫を持ち込まないようにすることが重要です。
   2. F2動物を15〜25°Cで育てます。
3. 統合されたトランスジェニック株の単離とバリデーション:
   1. 100%蛍光トランスジェニックF3線虫用のスクリーニングF2プレート。1つの非蛍光線虫の存在は、プレートを捨てるべきであることを示しているため、スクリーニングは非常に高速です。統合された導入遺伝子のF2動物ホモ接合体は、100%ホモ接合体蛍光子孫を与えます。
   2. 選択したプレートから8匹の蛍光F3動物を1匹採取し、導入遺伝子の100%の遺伝を確認します。理論的には、このステップでは1匹の動物を選ぶだけで十分です。しかし、不妊または不健康な動物の選択を避けるためには、蛍光F3を8匹選ぶ必要があるかもしれません。なぜなら、放射線照射は、線虫の生理学に重要な遺伝子に影響を与える突然変異をランダムに誘発する可能性があるためです。
   3. 可能であれば、いくつかの独立した統合トランスジェニック株、すなわち異なるF1動物から回収された株を保管してください。

結果

テーブル 1. C. elegansゲノムへの染色体外アレイの統合のための標準プロトコルと改良されたプロトコルの比較。ほぼ同じ周波数で伝達する2つの非統合導入遺伝子を、標準または改良されたプロトコルを使用して統合しました。主な違いは、標準プロトコルでは、トランスジェニックF2線虫の割合を推定するために、すべてのF1プレート上の子孫のスクリーニングが行われ、75%≥べきであるという事実にあります。このステップは、特に初期感染率が75%に近い場合、長い時間がかかります。改良されたプロトコルでは、トランスジェニックF2動物を運ぶ各F1プレートから4つのF2線虫を1匹ずつ選別し、子孫(F3)のトランスジェニック線虫の100%をスクリーニングするだけで十分であり、これは迅速に実施することができる。標準プロトコルが適応されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
U.V.クロスリンカー	フィッシャー・サイエンティフィック		波長254nm
顕微鏡 SteREO Discovery V8	カールツァイス株式会社
ペトリ皿、60 mm	CMLの	BPS55E6
プラチナ線0.25 mm	アルファ・アエサル	7440/06/04	ワームのピックを作るには