方法論記事

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

DOI：

10.3791/2017

⸱

2010年6月1日

 , 
1Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tリンパ球遊走には、リンパ器官、血管系から出口へのホーミング中に発生し、末梢組織に入る。ここで、我々は、Tリンパ球の遊走を分析するために使用できるプロトコルを記述する in vitroで。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tリンパ球の遊走は、他の細胞や細胞外マトリックスタンパク質と発現するリガンドと細胞表面のインテグリンの接着剤の相互作用を伴います。低親和性状態からセル最先端で高親和性状態へのインテグリンの正確な時空間的活性化は、Tリンパ球遊走に重要です。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。ヒトTリンパ球の分離

  1. 健康なドナーからのヒトの血液を入手してください。血液は、次のステップに進む前に室温（〜30分）に冷却してください。
  2. 8 mLの丸底ポリスチレンチューブに室温多形密度勾配媒体のピペット3mLの。ゆっくりと多形のメディアの上に全血3 mLを加える。 2種類の試薬の混合を避けることが重要です。
  3. 室温で45分間、500 × gでチューブを遠心する。
  4. 遠心分離に続いて、末梢血単核細胞（PBMC）は一番上のセルの層に他の血液成分から分離している。 PBMC層は、最初の曇りバンドとして、トップダウンから、表示されます。
  5. 慎重にPBMC層上に血の透明な黄色の上相を、削除し、15 mlまたは50 mlコニカルチューブにPBMC層を転送するためにP1000マイクロピペットを使用してください。
  6. 5分ごとに時間を500 × gで細胞を遠心分離し、PBSで2回PBMCを洗ってください。上清は、各洗浄後やや曇っ​​たようになります。

2。ヒトTリンパ球の培養

  1. ピペットを用いて、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1μg/ mlのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含む20mLのRPMI 1640培地でT - 75培養フラスコにPBMCを転送する。
  2. 37 ° C、5％は少なくとも1時間、および最大24....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この実験では、一次ヒトTリンパ球の運動性を分析するためにシンプルなシステムについて詳しく説明します。vitroでの遊走のアッセイでは多くの分子と種々の細胞型の運動に関与するシグナル伝達経路の役割を解明するために使用されている。我々のプロトコルから独自の実験を設計するとき心に留めておくべきいくつかの重要なコントロールが含まれます：1）、ウシ血清アルブミン（BSA）またはポリ- Lリジン（PLL）などの非接着または非インテグリン接着基質のコーティングを、それぞれ、2 ）インテグリン特異的にそのような我々のプロトコルで説明されているSDF - 1などの刺激シグナル、なし抗体のインテグリン特異性を決定するために、治療、および3）共同コーティングをブロック。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利害の衝突は宣言されません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトは、健康補助HL087088（MK）とHL18208（MK）の国立研究所によってサポートされていました。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMI 1640GIBCO、Life Technologies11875
FBSThermo Fisher Scientific, Inc.SH300070.03
ペニシリン-ストレプトマイシンGIBCO、Life Technologies15140
1ステップ多形AccurateChemical &サイエンティフィック・コーポレーションAN221725
PHARemel, サーモフィッシャー・サイエンティフィックR30852801
Rec. human IL-2R&Dシステムズ 202-IL
Rec. ヒト IL-15R&D Systems247-IL
Protein GSigma-Aldrich19459
Rec. human ICAM-1/FCR&Dシステム720-IC
Rec. 人間 SDF-1R&Dシステムズ350-NS
ズ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M.

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

ICAM 1 SDF 1 PHA

関連記事