移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

サマリー

Tリンパ球遊走には、リンパ器官、血管系から出口へのホーミング中に発生し、末梢組織に入る。ここで、我々は、Tリンパ球の遊走を分析するために使用できるプロトコルを記述する in vitroで。

要約

Tリンパ球の遊走は、他の細胞や細胞外マトリックスタンパク質と発現するリガンドと細胞表面のインテグリンの接着剤の相互作用を伴います。低親和性状態からセル最先端で高親和性状態へのインテグリンの正確な時空間的活性化は、Tリンパ球遊走に重要です。

プロトコル

1。ヒトTリンパ球の分離

1. 健康なドナーからのヒトの血液を入手してください。血液は、次のステップに進む前に室温（〜30分）に冷却してください。
2. 8 mLの丸底ポリスチレンチューブに室温多形密度勾配媒体のピペット3mLの。ゆっくりと多形のメディアの上に全血3 mLを加える。 2種類の試薬の混合を避けることが重要です。
3. 室温で45分間、500 × gでチューブを遠心する。
4. 遠心分離に続いて、末梢血単核細胞（PBMC）は一番上のセルの層に他の血液成分から分離している。 PBMC層は、最初の曇りバンドとして、トップダウンから、表示されます。
5. 慎重にPBMC層上に血の透明な黄色の上相を、削除し、15 mlまたは50 mlコニカルチューブにPBMC層を転送するためにP1000マイクロピペットを使用してください。
6. 5分ごとに時間を500 × gで細胞を遠心分離し、PBSで2回PBMCを洗ってください。上清は、各洗浄後やや曇っ​​たようになります。

2。ヒトTリンパ球の培養

1. ピペットを用いて、10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1μg/ mlのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含む20mLのRPMI 1640培地でT - 75培養フラスコにPBMCを転送する。
2. 37 ° C、5％は少なくとも1時間、および最大24時間CO _2。このステップでは、フラスコの表面に付着なる単球は、懸濁液に残っているリンパ球から分離することができます。短いインキュベーション（1時間）は、このステップで使用されている場合は、手順2.1で指定されているPHAで補うことなく、10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地を使用することは可能です。
3. 慎重に、フラスコからメディアのすべてを削除する50 mLコニカルチューブにそれを追加し、5分間500 × gで遠心。
4. 現在は主にリンパ球を含む細胞ペレットを、再懸濁し、そして10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、及び1μg/ mlのPHAを含む25mLのRPMI 1640培地を含む新たなT - 75フラスコに細胞を移す。
5. 3日間（PBMCの最初のインキュベーションが一夜だった場合2日間）を37℃でインキュベートする。成長の24時間後、それは新鮮な培地の15〜20 mLを加え、より大きなT - 175フラスコに転送する必要があるかもしれません。
6. 3日後、フラスコ、50 mLコニカルチューブに移すからメディアおよび一時停止中のリンパ球を除去するためにピペットを使用してください。 5分間、500 × gで遠心する。
7. 新しいT - 75または25mLの（T - 75）または50 ml（T - 175）10％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および20 ngのRPMI 1640を含むT - 175フラスコに細胞ペレットおよび転送細胞を再懸濁します/ mLのヒトIL - 2またはIL - 15。
8. 4-7日のためにリンパ球が成長する。 T - 75フラスコで始まる場合、文化は1〜2日後に拡大し、T - 175フラスコに転送する必要があるでしょう。

（3） 体外リンパ球遊走アッセイで

1. 遊走アッセイの前に1日、コートで20μg/ mLのタンパク質一晩4 PBSでまたはGとグラスボトム0.17ミリメートルディッシュ℃の
2. PBSで皿を洗う。
3. ディッシュにPBS溶液にこれらの試薬を加え、室温で4時間インキュベートすることにより、人間のICAM-1/Fc（10μg/ mLの）と、ヒトSDF - 1（2μg/ ml）を固定化する。
4. 第一血球計を使用してT - 175フラスコで培養中の細胞密度を決定することによって、Tリンパ球を準備します。約2〜5 × 10 ⁵細胞遊走の分析のために適切な細胞密度を達成するために皿ごとに使用する必要があります。
5. PBSで2回、Tリンパ球を洗浄し1 mg / mLのD -グルコースを含む1 mLのL - 15培地に再懸濁します。
6. 広範囲にPBSでICAM-1/FcとSDF - 1を塗布した皿を洗う。
7. 皿に1 mLのメディアにおけるTリンパ球を移し、37でそれらをメンテナンス℃に

4。 NISの要素ソフトウェアを用いた動画像のキャプチャ

1. NISの要素のソフトウェアを開きます。
2. カメラの設定メニューでは、ライブイメージングと画像キャプチャの両方のモードとして、"2x2ビニング"を選択してください。
3. アプリケーションメニューに移動し、実行定義/実験を選択してください。
4. 画像と画像のキャプチャシーケンスの長さの合計との間の時間の長さを選択してください。
5. 画像の集録を開始するには"Run"ボタンを押してください。
6. 細胞を追跡し、移行パラメータ（速度、パスの長さ、変位等）ImageJを、AutoQuantまたはVolocity（図1）を含むいくつかのソフトウェアパッケージ、のいずれかを使用して定量することができる。
7. 各セルとタイムポイントを収集する（図2）と、原点での各セルに共通の出発点（図3）をもつグラフ上に投影されるために生成するには"クモの巣のプロットを、"XY座標。

5。代表的な結果

IL - 2またはIL - 15、Tリンパ球のいずれかの存在下での培養の6日目として正のCD3の染色だけでなく、肯定的なCD4および/またはCD8染色によって決定される細胞の> 98％を、占める。 IL - 2の場合、我々は83％のCD4 +細胞を、15％CD8 +と<1％のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 IL - 15の場合、我々は88％のCD4 +細胞を、11％CD8 +と<1％のCD4 + CD8 +細胞を発見した。 ICAM-1/SDF-1基板上でのTリンパ球の移行時に、細胞は1時間の期間にわたって持続することができる約15μm​​/分の速度を示した。抗LFA - 1リガンド阻害抗体は、深刻な移行を阻害するとして。ICAM-1/SDF-1でTリンパ球遊走には、LFA - 1媒介接着に依存しています

図1。 Tリンパ球の移行の細胞追跡。Tリンパ球全血から分離し、6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養を10μg/ mLのICAM - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させたと濃度2μg/ mLのSDF - 1。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。

ビデオを見るにはここをクリック。
Tリンパ球の移行の動画1。細胞のトラッキング。全血と6日間IL - 2またはIL - 15の存在下で培養から分離されたTリンパ球は、10μg/ mLのICAM - 1および2μg/ mLのSDF - 1を塗布したガラス底皿に付着して移行させた。画像は、30分間10秒ごとに撮像した。細胞は、それぞれの画像で同定し、Volocityソフトウェアを使用して時間をかけて追跡した。この映画は、〜15μm/分の速度でTリンパ球のランダムな移行を示しています。

図2時空間セルの位置。各セルのXY座標がVolocityソフトウェアを使用して、各時点が得られた。

図3。"スパイダーウェブのプロット。"各セルのXYTの座標を使用して、15セルがランダムに選択し、原点を共通の出発点でプロットした。クモの巣プロットを比較すると、異なる実験条件間移行の違いを簡単に視覚的描写を与える。制御条件の下でTリンパ球遊走（左パネル）および抗LFA - 1リガンド阻害抗体（右パネル）の存在下でプロット。

ディスカッション

この実験では、一次ヒトTリンパ球の運動性を分析するためにシンプルなシステムについて詳しく説明します。vitroでの遊走のアッセイでは多くの分子と種々の細胞型の運動に関与するシグナル伝達経路の役割を解明するために使用されている。我々のプロトコルから独自の実験を設計するとき心に留めておくべきいくつかの重要なコントロールが含まれます：1）、ウシ血清アルブミン（BSA）またはポリ- Lリジン（PLL）などの非接着または非インテグリン接着基質のコーティングを、それぞれ、2 ）インテグリン特異的にそのような我々のプロトコルで説明されているSDF - 1などの刺激シグナル、なし抗体のインテグリン特異性を決定するために、治療、および3）共同コーティングをブロック。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI 1640	GIBCO、Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
ペニシリン-ストレプトマイシン	GIBCO、Life Technologies	15140
1ステップ多形Accurate	Chemical &サイエンティフィック・コーポレーション	AN221725
PHA	Remel, サーモフィッシャー・サイエンティフィック	R30852801
Rec. human IL-2	R&Dシステム	ズ 202-IL
Rec. ヒト IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/FC	R&Dシステム	720-IC
Rec. 人間 SDF-1	R&Dシステム	ズ350-NS