Photomotor Response Assay:照明条件の急激な変化に対するゼブラフィッシュ仔魚の行動反応を測定する方法

Abstract

出典:Steele, W. B., et al.幼魚の行動応答プロファイルを調べるための実験的プロトコル:神経刺激剤カフェインへの応用。(2018年)。

このビデオでは、自動追跡ソフトウェアを使用したゼブラフィッシュとファットヘッドミノーの幼生の光運動応答アッセイについて説明しています。このプロトコルは、照明条件の突然の変化に続く幼魚の行動反応を測定します。

Protocol

1. ビデオトラッキングパラメータのキャリブレーション

1. 行動測定を行う前に、ビデオトラックソフトウェアで観察およびキャリブレーションパラメータを設定します(材料の表を参照)。
   1. 個々のウェルに少なくとも1匹の幼魚を入れたウェルプレートを記録チャンバーに入れます。プレートと関連する魚を表現として使用して、キャリブレーション パラメーターを設定します。
   2. ビデオトラックソフトウェアで、「ファイル|「プロトコルの生成」をクリックすると、「プロトコル作成ウィザード」ダイアログボックスが開きます。「Location Count」フィールドに、ウェルプレートの個々のウェルの数を入力し、「OK」をクリックします。
   3. 画面上部の「表示 |フルスクリーン」と表示され、ウェルプレートのオーバーヘッドカメラビューを表示するようにシステムに促します。
   4. 「エリアを描画」アイコンをクリックすると、3つの色とりどりの図形として表示されます。ウェルプレート表示領域の右側にある「Areas」とラベル付けされたフィールドの円アイコンを選択します。
   5. カーソルを使用して、ウェルプレートの左上のウェルにある円形のビデオトラッキング領域を描きます。「右上のマーク」を選択し、右上の表示領域の輪郭をしっかりと描きます。次に、「ボトムマーク」を選択して、右下の輪郭をしっかりと描きます
      注: 円形のアウトラインを描画した後、その位置を調整する必要があります。アウトラインの位置を調整するには、[選択] をクリックし、カーソルを使用してアウトライン領域を移動します。また、アウトラインは「コピー」をクリックしてから「貼り付け」をクリックすることで複製できます。
   6. 左上、右上、右下のウェル追跡エリアを定義したら、[ビルド]をクリックして、残りのウェルの表示エリアを自動的に描写するようにソフトウェアに促します。
   7. 「キャリブレーション」とラベル付けされた領域で、「ドロースケール」をクリックします。カーソルを使用して、プレートを横切る水平線を描画します。線が引かれると、「キャリブレーション測定」というラベルの付いたダイアログボックスが表示されます。ウェルプレートの長さを入力し、「OK」をクリックします。
   8. 「描画領域」アイコンをクリックして、描画マネージャーを終了します。
   9. [タイル] アイコンをクリックします。カーソルを使用して、表示画面に表示されるすべてのボックスを強調表示し、各ボックスを緑色にします。
      メモ: タイルアイコンは、6 つの個別の小さな正方形のグループとして表示されます
   10. 「表示|フルスクリーン」。プレート表示領域の右側にある「Detection Threshold」とラベル付けされたボックスの「Bkg」をクリックします。しきい値調整バーを使用して、ピクセル検出しきい値を設定します。適切なピクセル検出しきい値を選択したら、[グループに適用]をクリックします。
       注:このプロトコルは、ゼブラフィッシュの観察ではブラックモードで検出しきい値を13に、ファットヘッドミノーの観察では透明モードで110に設定します。
   11. 「移動しきい値」というラベルの付いたボックスに、目的の移動速度追跡パラメータを入力します。速度パラメータを設定したら、「グループに適用」をクリックします。
       注:このプロトコルでは、小さい/大きい動きを20 mm / sに設定し、非アクティブ/小さな動きを5 mm / sに設定します。これらの選択は、非アクティブ(凍結)= <5 mm/s、小型(巡航)= 5〜20 mm/s、大型(破裂)= >20 mm/sの3つの異なる速度レベルで幼魚の動きを追跡するようにソフトウェアをプログラムします。
   12. 「Parameters |[Protocol Parameters] を選択します。ダイアログボックスで、「時間」タブを選択します。観測時間と積分時間を入力します。パラメータを入力したら、「OK」をクリックします。
   13. 各日長の明暗日長時間と光の強度を設定するには、「パラメータ」ドロップダウンメニューから「光の運転」を選択して、光ドライバー設定ダイアログボックスを開きます><。 注意: 複数の明暗日長の設定については、プロトコルビデオを参照してください。
   14. ビデオトラッキングパラメータを設定したら、観測プロトコルを保存します.
       注:このプロトコルは、10分間の順化フェーズとそれに続く2つの10分間の光期と2回の10分間の暗期からなる4つの変化する明暗期を含む50分間にわたって魚の行動を観察します。積分時間は、50 分間の行動試行の各分の動作を測定するように設定されます。

2. 魚の幼生の運動行動と光運動行動の観察

1. 実験魚類の入ったウェルプレートを行動記録室に置きます。
2. ビデオ追跡ソフトウェアで、次の手順で開発した追跡プロトコルを開きます。
3. ビデオ トラッキング ビューアで、すべての幼虫がコンピューター画面に表示されていること、各ウェルに 1 匹の幼虫のみが存在すること、および個々のウェルがステップ 1.1.5 と 1.1.6 で定義した観察エリア内に位置合わせされていることを確認します。
4. 「Experiment |実行".
   注:システムは、観測データを保存する名前と場所を提供するようにユーザーに求めます。
5. 観測データの名前と保存場所を指定したら、「複数のライブ画像」アイコンをクリックして、事前定義されたすべての表示領域を強調表示します
   メモ: このアイコンはコンピュータ画面の上部にあり、4 つの小さな正方形に分割されたボックスとして表示されます。このアイコンをクリックすると、事前定義されたすべての表示領域が強調表示されます。
6. 録音チャンバーのパネルを閉じ、「背景|コンピューターのモニターで「開始」。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	08-772-52	ゼブラフィッシュ幼虫の行動記録室
24ウェルプレート	VWRの	10062-896	幼虫のファットヘッドミノー行動記録室