Prey Capture Assay:ゼブラフィッシュ幼生の獲物捕獲行動を研究する方法

要約

出典:武藤、A.、他 2光子レーザーを用いたニューロン集団のアブレーションと、ゼブラフィッシュ幼生におけるカルシウムイメージングと行動記録を用いたその評価。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、獲物捕獲アッセイについて説明しています。このビデオでは、特定のニューロンをレーザーアブレーションした後のゼブラフィッシュの幼生の獲物捕獲行動を研究する方法について説明しています。

プロトコル

1. レーザーアブレーション後の行動影響の評価

1. ビデオカメラを搭載したステレオスコープで構成されたビヘイビアレコーディングシステムを設定します。商用またはカスタムメイドの適切な画像取得ソフトウェアを備えたカメラを使用します(図1A)。
2. 画像処理でゾウリムシを検出できるように、照明条件を最適化してください。たとえば、スペーサー付きのリング白色LEDライトを使用します(図1B).
   注:LEDからの距離と角度は、サンプルの外観(つまり、暗い背景で明るいか、明るい背景で暗いか)に影響を与えるため、画像処理を成功させるために重要です。スペーサーの最適な高さを決定します(図1C)。
3. ゼブラフィッシュの幼生(セクション1で説明したレーザーアブレーション実験から回収)を、元の上部シールを剥がした行動記録チャンバー(スライドガラスに取り付けられていた)に入れます(図1D)。
4. ビーカーから水に懸濁したゾウリムシをマイクロピペットで50匹採取し、記録室に入れます。
5. 録音チャンバーの上にカバースリップを置きます。記録チャンバーの水面に置く前に、カバースリップに小さな水滴を垂らして、チャンバー内に空気が入らないようにします.
   注:このステップでは、ゾウリムシを含む一部の水が記録チャンバーからオーバーフローします。記録室内のゾウリムシの残りの数は約30〜40になります。
6. 記録チャンバー(幼虫とゾウリムシを含む)を照明システムに配置します(図1D)。
7. 10fpsで11分間(6,600フレーム)のタイムラプス撮影を開始します。
8. (オプション)行動について試験された各幼虫について、レーザーアブレーション領域の蛍光を蛍光顕微鏡で観察して、レーザーアブレーションの有効性を確認します(つまり、レーザー照射領域に蛍光細胞が存在しない、または大幅に減少します)
   注:照射後も、アブレーション後に分化した細胞ではGal4遺伝子の発現が後から開始されるため、一部の蛍光細胞が観察されます。
9. 幼虫の行動を記録した後、背景の均一性の欠如を補うために、フィジーで各フレームを平均画像でピクセルごとに分割します:「プロセス」、「画像計算機」、「操作:除算」、「32ビット(浮動小数点)結果」、「OK」をクリックします。平均的な画像を作成するには、[画像]、[スタック]、[Zプロジェクト]、[平均強度]、[OK]をクリックします(図1E、F)。
10. 「分析」、「粒子の分析」をクリックし、すべてのゾウリムシをカバーする領域範囲を設定し、「表示:マスク」チェックボックスにチェックを入れ、「OK」をクリックして、チャンバーに残っているゾウリムシの数を数えます。「Show:Masks」オプションは、抽出されたゾウリムシ画像(図1G)と、各フレーム内の粒子(ゾウリムシ)の数のリストを提供します。
11. 記録チャンバーに残っているゾウリムシの数を経時的にプロットします。ゾウリムシの数の推定値にはノイズが多いため、スプレッドシート上の 600 フレーム (1 分) の範囲で各ポイントで移動平均を実行することをお勧めします。

結果

図 1.レーザーアブレーションされたゼブラフィッシュの幼生における獲物捕獲アッセイと代表データ。(A)行動記録システム。実体顕微鏡にはCMOSカメラが搭載されていました。画像はカスタムメイドのスクリプトを使用して取得されました。(B)照明システムのコンポーネント。グレーの紙、ガラスのディフューザー、白色LEDリングライト、ディフューザー、特注のスペーサー(段ボール)、中央に穴が開いたディフューザー。(C)Bに示す部品から組み立てられた照明システム(D)獲物捕獲アッセイのための記録チャンバー。チャンバー(直径20mm、深さ2.5mm)をスライドガラスの上に置いた。チャンバーの元のトップシールは剥がされました。録音室にはガラスカバーが取り付けられていました。(e)記録された...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
イメージチャンバー	グレースバイオラボ	カバーウェルイメージングチャンバー PCIA-2.5	ビヘイビアレコーディングチャンバーとして使用
オルカフラッシュ4.0	浜松ホトニクス	モデル:C11440-22CU	科学用CMOSカメラ
SZX7	オリンポス		実体鏡
リングLEDライト	CCSの	モデル: LDR2-100SW2-LA	白色LED
セキュアシールハイブリダイゼーションチャンバーガスケット、8チャンバー、直径9 mm x 深さ0.8 mm	分子プローブ	カタログ#S-24732	Caイメージングの記録室として使用