エスケープレスポンスアッセイ:ゼブラフィッシュの幼虫の触覚刺激に対する反応を研究する方法

要約

出典:Sztal, T. E., et al.ゼブラフィッシュの筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためのタッチ誘発反応と移動アッセイの使用。(2016年)

このビデオでは、ゼブラフィッシュの幼虫が触覚刺激に対する反応を測定する触覚誘発反応アッセイについて説明しています。

プロトコル

1. タッチ誘発反応アッセイ

1. タッチ誘発反応アッセイのための2 dpf胚の調製
   1. アクティビティは一日を通して劇的に変化する可能性があるため、テストが実施される時刻が実験間で一貫していることを確認してください。
      注:実験は盲検化して実施し、実験のアーティファクトを最小限に抑えるためにテストの順序をランダムにする必要があります。
   2. 魚の株に番号を割り当てますが、これは実験を実行する個人には不明です。これに続いて、無料で入手できるオンラインツールを使用すると、テストの順序を決定するランダムなリストが生成されます。
   3. テストの少なくとも1時間前に、絨毛膜に穴を開け、細いピンセットを使用して絨毛膜をそっと引き離して胚を脱毛します。28°Cインキュベーターに戻る前に、シャーレから破片を取り除きます。
2. タッチ誘発反応アッセイの実施
   1. 試験開始の少なくとも15分前にステージを28°Cに加熱します.
      注:このステージは温度制御されており、テスト期間中は28°Cに保たれます。温度は活動に影響を与えるため、一定の温度を維持することが重要です。加熱ステージが利用できない場合は、水の温度を監視し、すべての実験を同じ温度で実施する必要があります。
   2. 胚培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl₂、0.33 mM MgSO₄ in water)を充填したシャーレを照明付きステージに置き、ハイスピードカメラをシャーレに取り付けます。
   3. ビデオカメラ録画ソフトウェア(Stream Pix 5など、ここで説明)を起動し、[ワークスペース]タブでキャプチャ速度として1,000フレーム/秒(1,000 fps)を選択して、魚の速い水泳アクションが記録されるようにします。
   4. 一度に1つの胚で作業し、ゼブラフィッシュが視野にはっきり見えるように、胚をペトリ皿の中央に置きます。
      注:実験の開始前に胚が泳ぎ去った場合、胚の再捕獲と配置により刺激に対して鈍感になり、バースト応答を繰り返すと一部の疾患モデルで筋力低下が促進される可能性があるため、胚を別の胚と交換します。
   5. 「録音」ボタンをクリックして記録を開始し、頭のてっぺんにある鈍い針で胚に優しく触れて、機械感覚刺激を胚に送達します。
   6. 胚が視野から泳いで出たり、静止に戻ったら、記録を停止します。
      注:加速度は、機械的刺激に続くバーストエスケープ応答の最初の0.2秒以内にピークに達します。したがって、少なくともエスケープ応答の記録の最初の 0.2 秒間は、魚が視野内にあることを確認します。ソフトウェアStream Pix 5を使用すると、データは自動的に.aviビデオファイルとして保存されます。Free Video CaptureやSoftonicなどの代替ビデオキャプチャソフトウェアも使用でき、どちらも無料でダウンロードできます。
   7. 胚を新しいシャーレに戻し、別の胚を選択して試験します。最低15匹の魚でテストを実行します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
90mmシャーレ	パシフィックラボラトリー製品	PTのS90001
ピンセット、スタイル8	プロサイテック	T04-821
孵卵器	サーモライン・サイエンティフィック	TEI-43L
ハイスピードカメラ	バウマー	HXC20
ストリームPIX5	ノーピックス		ステップ 1.2.3
温度制御ユニット	見方
http://www.randomization.com	該当なし		ステップ 1.1.2