胚ベースの化学毒性スクリーニング:ゼブラフィッシュ胚の発生に対する影響の評価

要約

出典:Hao J. et al., Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen.J. Vis. Exp. (2010年)

この記事では、ゼブラフィッシュの胚を化学的毒性スクリーニングに使用しています。化学的毒性は、表現型の読み出しと相関しています。サンプルプロトコルは、化学的毒性スクリーニングを実施するための方法論的アプローチを示しています。

プロトコル

1. 低分子ライブラリの転送

ロボットによる搬送でも化合物の搬送は自動化できますが、ここでは手動の搬送方式について解説します。

1. 低分子ライブラリーは通常、96ウェルフォーマットで提供され、各化合物は10 mMストックとしてDMSOに保存されます。胚が化合物を添加する段階に達する約60分前に、低分子のアリコートを含む96ウェルプレート(ソースプレート)を所望の数だけ解凍します。ソースプレートのシリアル番号またはその他の識別番号をメモします。プレート上の結露を最小限に抑えるために、ドライエライト(W.A. HAMMOND DRIERITE CO、Xenia、OH)を含む乾燥チャンバーで解凍を行うことができます。
2. マルチウェルプレートアダプターを装備した卓上遠心分離機でプレートを短時間スピンダウンします。
3. アルミ製シーリングテープをソースプレートからはがします。12チャンネルピペットを使用して、ソースプレート中の化合物を0.5 mMの濃度に希釈します(たとえば、10 mMストックの250 nLアリコートから開始する場合は、各ウェルに4.75 μLのDMSOを追加します)。
4. 96ウェルプレート(レシピエントプレート)の胚が目的のステージに到達したら、12チャンネル(2-20 μL)ピペットを使用して、2.5μLの化合物(0.5 mM)をソースプレートから胚を含むレシピエントプレートに移します。
5. レシピエント胚プレートにソースプレートの識別番号を記録します。胚と化合物が入っているレシピエントプレートを蓋で覆い、プレートを穏やかに渦巻かせて混合し、28.5°Cのインキュベーターに入れます。
6. 未使用の低分子(0.5 mM)を含む各ソースプレートをアルミニウム製シーリングテープで覆い、-80°Cの冷凍庫で長期保存します。

2. 表現型の目視検査による低分子の影響スクリーニング

1. スクリーニングを実行する前に、「ヒット」を構成するものについて具体的な基準を策定します。
2. 開発の希望する時期に、化合物処理された胚を含む96ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、実体顕微鏡で各ウェルを検査します。循環パターンの変化などの微妙な変化をよりよく視覚化するために、位相差倒立顕微鏡を使用することができます。蛍光顕微鏡法は、組織特異的プロモーター下でのGFPまたはDsRedタンパク質の発現の摂動を調べるために使用できます。
3. 96ウェルプレートをすばやくスキャンして、5つの胚のうち少なくとも3つが所定の「ヒット」表現型を示すウェルを探します。プレートの同一性と、各ヒット候補のウェル位置を記録します。
4. 化合物の効果を数回(1 uM、5 uM、10 μM、50 μM)で再試験することにより、潜在的なヒットを再確認します。各用量で、10個の胚を0.5 mLのE3培地で48ウェルプレート形式で試験します。再試験のための化合物添加のタイミングは、元のスクリーニングのタイミングと同じである必要があります。化合物の再試験で誘発された表現型が再現されると、ヒットが確認されます
5. 化学ライブラリーの低分子のデータベースからヒット化合物を同定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMSOの10 mMストックに96-wll形式で配列された構造的に多様な化合物の低分子ライブラリ。各マスタープレートは、96ウェルポリプロピレン製保存プレート(コーニング)に分注され、 まで-80°Cで保存されます 使う。
ドライエライト	WAハモンドドライライト株式会社、オハイオ州クセニア
12チャンネルピペット、2-20 μL	エッペンドルフ
96ウェルプレート用アルミシールテープ	Nunc、ニューヨーク州ロチェスター
DMSOの	シグマ、セントルイス、ミズーリ州
ベーシックインキュベーター、28.5°C	フィッシャーサイエンティフィック
ポリスチレン製96ウェル丸底アッセイプレート	コーニングCOSTAR;マサチューセッツ州ローウェル
透過光ベース付き実体顕微鏡	Leica Microsystems、イリノイ州バノックバーン
E3胚培地:5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4、0.003% PTU(フェニルチオカルバミド、Sigma、ミズーリ州セントルイス)を含む。			PTUは、0.3 g PTUを1 LのE3胚培地に溶解することにより、10倍溶液として調製できます。PTUを含む溶液は、アルミホイルで覆うことにより光から保護する必要があります。