標的肝臓アブレーション:トランスジェニックゼブラフィッシュ幼生におけるメトロニダゾールによる肝細胞死の誘導

要約

出典:Choi T.Y., et al. 胆道主導の肝臓再生を研究するためのゼブラフィッシュの肝細胞特異的アブレーション。J. Vis. Exp. (2015年)

この記事では、トランスジェニックゼブラフィッシュの幼生にメトロニダゾールによる肝細胞死を誘発する方法である、標的を絞った肝臓アブレーションについて説明しています。サンプルプロトコルは、ゼブラフィッシュの標的肝臓アブレーションを生成、操作、および評価するプロセスを説明しています。

プロトコル

1. 胚/幼虫の準備

1. 100個の胚を25mlの卵水を入れた100mmのシャーレに移します。シャーレ1枚につき100個以下の胚を保管し、28°Cで育てます。
2. 色素沈着を抑制するには、受精後10時間(hpf)の前にフェニルチオ尿素(PTU)をシャーレに追加し、胚/幼虫を80hpfまで育てます。.PTUの最終濃度は0.2 mM.
   です。 注意:PTUは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
3. 3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)を最終濃度0.016%でペトリ皿に追加して、幼虫に麻酔をかけます。次に、落射蛍光顕微鏡を使用して、CFP陽性の幼虫を選別します。肝臓のサイズが似ている幼虫を使用し、肝臓が小さいまたは大きい幼虫は捨ててください
   注:半接合幼虫とホモ接合幼虫の間で肝細胞アブレーションの程度に差がないため、強度に関係なく、任意のCFP陽性幼虫を使用できます
   注意:トリカインは有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
4. トリカインを含む卵水を取り除き、0.2 mM PTUを添加した卵水を加えます。胚/幼虫を28°Cに保ちます。

2. Mtzの扱い

1. 0.2% DMSOおよび0.2 mM PTUを添加した100 mLの卵水に0.171 gのMtz粉末を溶解することにより、新鮮な10 mM Mtz溶液を調製します。Mtzを完全に溶解するには、RTで溶液を20〜30分間急速攪拌して混合します。Mtzを可溶化し、幼虫へのMtzの浸透を促進するために、Mtzを調製するときにDMSOを追加します.
   注意:Mtzの長期暴露または濃度の増加は有毒です。適切な取り扱いガイドラインに従って使用してください。
2. 幼虫をコントロールグループと実験グループに分けるには、必要な数の幼虫を2つの異なる100mmシャーレまたはマルチウェルプレートに移します。実験グループでは、幼虫を10 mM Mtz溶液に入れます。対照群については、0.2%DMSOを含む卵水に保管してください。
3. Mtz溶液の入ったプレートまたはシャーレをアルミホイルで覆い、Mtzの光不活性化を防ぎ、28°Cでインキュベートします。Mtz治療の期間は、幼虫の病期とトランスジェニック系統によって異なります。

3. 胆道駆動型肝再生の解析

1. アブレーション期間の終わりに、プレートからMtz溶液を取り除きます。Mtzで処理した幼虫を25mlの卵水を加えて洗います。プレートを2〜3回回して幼虫を洗い、卵の水を捨てます。これを3回繰り返してから、幼虫をもう一度卵の水に浸します。Mtzで治療された幼虫の心臓浮腫と幼虫の死を避けるために、最終濃度の0.008%で低濃度のトリカインを追加して、幼虫を固定します。.
2. 肝臓分析では、CFPフィルターを使用した落射蛍光顕微鏡でMtz処理された幼虫の肝臓サイズを調べます。相対的な肝臓のサイズに基づいて肝細胞のアブレーションレベルを評価します:大(非アブレーション; 0-10%幼虫)、中(部分的にアブレーション; 10-20%)、および非常に小さい(完全にアブレーション; 80-90%)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-アミノ安息香酸エチルエステル(トリカイン)粉末	シグマ・アルドリッチ	A5040 (英語)	0.4%(15 mM)トリカインストックを作る:0.4 gのトリカインを卵水で100 mLにします。pH 7に調整します。
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ・アルドリッチ	D8418
メトロニダゾール	シグマ・アルドリッチ	M1547
N-フェニルチオ尿素(PTU)	シグマ・アルドリッチ	P7629
100 x 15 mmシャーレ	デンビルサイエンティフィック株式会社	M5300
卵の水			0.3 g/L の海塩「インスタントオーシャン」と 0.5 mM CaSO4 の蒸留水。
落射蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	M205FA

型 の