モルフォリノ注射:ゼブラフィッシュの機能研究のための標的遺伝子発現をノックダウンする方法

要約

出典:Hyde D.R., et al. 再生成体ゼブラフィッシュ尾鰭へのモルフォリノスの生体内エレクトロポレーション。J. Vis. Exp. (2012年)

このプロトコールは、尾部へのモルフォリノ注射によるゼブラフィッシュの遺伝子発現の標的ノックダウンについて説明しています。

プロトコル

1. モルフォリノ注射

1. モルフォリノを注入する前日に、注入プレートを作成します(図1)。ウェルの一方の端に切り込みを入れておくと、マイクロインジェクションの手順で魚を安定させることができます。
2. フルオレセインタグ付きモルフォリノを適切な濃度(1.2 mMから始めることを推奨)に希釈し、65°Cの水浴に5分間入れます。
3. モルフォリーノを針にセットします(注:バックフィルするかフロントロードするかによって、針を最初にロードするか、チップを最初にカットするかが決まります)。
4. 針の先端を斜めに切り落とします。
5. マイクロインジェクションシステムの指示に従って、インジェクションごとに約5nlのモルフォリノバブルを注入します。.モルフォリノの量が多いと、組織を破壊する可能性があります。
6. 魚に麻酔をかけ、注射プレートに置きます。余分な液体をすべて取り除き、針を骨光線のすぐ遠位にある適切な位置に向けます(図2)。モルホリノ注射に適した顕微鏡およびマイクロインジェクション装置(Specific Reagentsの表を参照)を使用して、図2に示すように、モルフォリノをフィンの前方から後方に注入します。後方から前方への注入は、注入中にフィン組織が巻き上がってしまい、非常に困難です。
7. 針を再生組織にそっと挿入し、各骨光線(図2の「1」とマークされています)のすぐ遠位に挿入し、芽球(図2の「2」とマークされています)に位置するまで遠位に押します。針がフィン全体に押し込まれないように注意してください。針が正しく位置を特定したら、モルフォリノを注入します(つまり、1回クリックします)。1.2 mMでは、フルオレセインタグ付きモルフォリノ溶液は、通常の光条件下でも黄緑色に見えます。注入するたびに、モルフォリノ溶液の黄色い「パフ」を視覚化でき、注入を芽腫に局在させるのに役立ちます。骨光線ごとに約75 nl(10-15クリック)のモルフォリノ溶液を注入する必要があります。.クリックの間隔を ~ 1 秒押します。背側のみを注入し、腹側をエレクトロポレーションのみのコントロールとして使用します。

結果

図1. A.アガロースから作られ、モルフォリノのマイクロインジェクション中に魚を保持するための小さなウェルを含む注入プレートの概略図。

図 2. モルフォリノマイクロインジェクションの概略図。 A. 魚の頭を井戸から切り抜いた切り込みに入れて皿に魚を置きます。これにより、魚は安定します。B. 低倍率では、針がヒレの再生組織に近づくように配置してください。 C. 高倍率では、 モルフォリノを各骨のヒレ光線(すなわち、各芽球)に遠位に注入します。針は骨光線のすぐ遠位にある組織に入り(1...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
モルフォリーノ	GeneTools, LLC (ジェネツールズ合同会社		モルフォリノは、関心のあるタンパク質に合わせてカスタム設計する必要があります
マイクロインジェクションポンプ	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	PV830	空気圧PicoPump多くの異なるマイクロインジェクションシステムを使用することができます
マイクロマニピュレーター	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	MMJRの	右利き (MMJL は左利き用)
マイクロインジェクションニードル、外径1.0 mm	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	1B100F-4	これらはホウケイ酸ガラスの毛細血管で、針に引っ張られています
ニードルホルダー	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株)	5430-すべて	ピコノズルキット;1.0mmピペットガスケットをはめ込んでください
ニードルプーラー	サッターインストゥルメント株式会社	P-97	他のマイクロピペット/ニードルプーラーも動作するはずです
顕微鏡	ライカ、ニコン、ツァイス	メーカーにより台数が異なります	20倍の光学系とマイクロマニピュレーターとの連携が可能な実体顕微鏡
2-フェノキシエタノール	シグマ・アルドリッチ	77861から1L	麻酔;処置のために魚系水で1:1000、安楽死のために1:500で希釈