交配と卵のステージング:胚を生成し、発生段階ごとに選別する方法

Abstract

出典:Hostelley T.L., et al. ゼブラフィッシュのRNASeqベースの遺伝子発現データのサンプル調製と分析。J. Vis. Exp. (2017年)

この記事は、ゼブラフィッシュの胚を自然交配と選別によって生成するプロトコルについて説明しています。このプロトコルは、トランスジェニックフィッシュを使用した膵臓β細胞の分析にさらに使用されます。

Protocol

1. 自然交配による胚の生成

1. 生後3ヶ月までの培養胚、生殖成熟
。
2. 胚採取の前夜に、目的の系統から成魚の雄と雌の魚を分割された交配水槽に分離し、各水槽に2匹の雄と3匹の雌を追加します。
   注:トランスジェニックinsulin2a:mCherry蛍光レポーター株の使用により、膵臓β細胞の分析が可能になりました。
3. 魚を新鮮なシステム水で交配水槽に移し、翌朝ライトが点灯したらすぐに仕切りを取り外します。
4. 胚が底のタンクで観察されるまで、魚が自然に交尾するのを待ちます。希望の量が収集されるまで、30分間隔で胚を収集します。収集した各時点を別々のシャーレに入れ、28.5°Cの胚培地で保存します。
5. 必要に応じて、遺伝物質のマイクロインジェクションまたは実験用培地への配置を行い、新鮮なハンクの胚培地で胚を10cmのシャーレで28.5°Cで培養します
   注:モルフォリノ(MO)を注入した動物または変異動物における遺伝子発現解析では、各操作が遺伝子発現に偶発的な影響を与える可能性があることに注意してください。変異体は、MOベースの遺伝子標的化では観察されない転写レベルで遺伝的補償を示すことができます。

>2. ステージ胚

1. 10cmのペトリ皿あたり50〜75個の胚のグループで胚を培養し、すべての胚の一貫した発生タイミングを促進します。
2. 割球、エピボリー、体節の各段階で解剖顕微鏡を用いて発生形態をモニターし、発生の進行を確認します
   注:皿の発達遅延を防ぐために、死にかけている胚や奇形の胚をすべて取り除きます。
3. 発生年齢に基づいて胚を分離します。胚と幼虫を24 hpf.
   後の全身長を使用してステージングします。 注:体節は、胚の背側部分に存在する山形の中胚葉組織です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mチェリー	ジルク	ZL1483
嵌合タンク 1.0L クロッシングタンクセット	アクアニアリング	ZHCT100
解剖顕微鏡	ツァイス