テールクリップからのDNA抽出:ゼブラフィッシュのジェノタイピングに用いる手法

要約

出典:Xing L., et al.高分解能融解解析によるPCRを用いた迅速かつ効率的なゼブラフィッシュジェノタイピング。J. Vis. Exp.(2014年)。

この記事では、ゼブラフィッシュのテールクリップからのDNA抽出について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの遺伝子型を迅速かつ効率的に解析する方法を実証しています。

プロトコル

1. DNA調製

1. DNA溶解バッファーを調製します:50 mM KCl、10 mM Tris-HCl pH 8.3、0.3% Tween 20、0.3% NP40。使用日に新鮮なプロテイナーゼKを最終濃度1 mg / mlまで加えます。.
2. ティッシュコレクション:
   1. 大人の魚のひれクリップの場合:
      1. 魚に麻酔をかける:魚を0.004%MS-222(トリカイン)溶液に入れます。鰓の動きが遅くなるまで待ちます。
      2. 5〜10個のキムワイプの積み重ねに魚を置き、滅菌済みのかみそりの刃で尾びれの小片を約2〜3mm切ります。
      3. 回収のために、真水が入ったラベル付きの水槽に魚をすばやく入れます。水槽とフィンクリップが入る対応するチューブの両方に慎重にラベルを付けます。水を交換し、一日おきに魚に餌をやります。
      4. 滅菌ピペットチップ付きのフィンクリップをつまみ、100 μlのDNA溶解バッファーで満たされたチューブに移します。
      5. ピペットの先端を捨て、かみそりの刃を鋭利な容器に捨てます。
   2. 胚テールクリップの場合:
      1. 胚を0.004%MS-222(トリカイン)溶液に入れます。2分待ちます。
      2. 解剖顕微鏡で鉗子で尾を切断します。
      3. 30 μlのDNA溶解バッファーを充填した標識チューブにテールを入れます。
      4. 胚を100μlの4%パラホルムアルデヒドを含むチューブにすばやく入れます。
      5. 胚とそれに対応する尾管でチューブをラベル付けします。
      6. 胚を入れたチューブを4°Cで一晩保存し、固定します。
      7. ミリQ水と各胚間のキムワイプを使用して鉗子を洗浄し、汚染を最小限に抑えます。
   3. 全胚の場合:
      1. 胚を0.004%MS-222(トリカイン)溶液に入れます。2分待ちます。
      2. 100 μlのDNA溶解バッファーで満たされたチューブに1〜5個の胚を入れます。デコレーションは必要ありません。
3. DNA消化
   チューブを組織(フィンクリップ、テールクリップ、または胚)と55°Cで4時間から一晩インキュベー
トします。
4. プロテイナーゼK
   を不活性化します DNAは、すぐにPCRに使用するか、または-20°Cで最大3ヶ月間保存する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100リアクションライトスキャナーマスターミックス	バイオファイア	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
トリカイン
パラホルムアルデヒド