ライトシート顕微鏡サンプル調製:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウント

Abstract

出典:Icha J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development.J. Vis. Exp.(2016年)。

この記事では、ライトシート蛍光顕微鏡のサンプル調製について説明します。また、ゼブラフィッシュの生きた胚を長時間イメージングする方法も示しており、これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録することができます。

Protocol

1. サンプル調製

1. アガロースミックスの準備
   1. アガロースミックスを作る15分前に、1%低融点アガロース(E3培地に溶解)の1 mLアリコート1つを70°Cに設定した加熱ブロックで溶かします。アガロースが完全に溶融したら、600 μlを新しい1.5 mLチューブに移し、E3培地250 μl、0.4% MS-222 50 μl、ボルテックスビーズストック溶液25 μlを加えます
      手記：これにより、925μlの混合物が作成され、さらに75μlが後で胚と一緒に追加される液体に対して計算されます。
   2. チューブを38〜40°Cの2番目の加熱ブロックに保持するか、アガロースがゲル化点に非常に近いことを確認してから、サンプル胚をチューブに入れます。
2. 胚のマウント
   1. 容量20 μlのガラスキャピラリー5本(内径~1 mmの黒印)を手に取り、対応するテフロンチッププランジャーを挿入します。プランジャーをキャピラリーに押し込み、テフロンチップがキャピラリーの下部にくるようにします。
   2. ガラスまたはプラスチックのピペットで5つの胚(一度にマウントできる数)をボルテックスした37°Cの温かいアガロースミックスのチューブに移します
      手記：胚と一緒に最小限の量の液体を運ぶようにしてください。
   3. 毛細血管をミックスに挿入し、プランジャーを引き上げて1つの胚を内部に吸い込みます。胚の頭部が尾の前の毛細血管に入ることを確認します。プランジャーとサンプルの間に気泡が入らないようにしてください。胚の上に±2 cm、その下に±1 cmのアガロースがあるはずです。残りの胚についても繰り返します。
   4. アガロースが完全に固まるまで待ち、数分以内に発生し、サンプルを粘土またはテープでビーカーの壁に貼り付けて、E3培地に保管します。キャピラリーの底部の開口部は、サンプルへのガス交換を可能にするために、溶液中に自由にぶら下がっている必要があります.
      注:セクション1.1および1.2と同様のプロトコルは、OpenSPIMのwikiページ http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation にも記載されています。

2. サンプルの配置

1. サンプルホルダーアセンブリ
   1. 適切なサイズ(黒)の2つのプラスチックスリーブを互いに押し合わせてサンプルホルダーステムに挿入します。スリットの側面は外側を向く必要があります。クランプネジを2〜3回転させて緩めます。キャピラリーをclに挿入しますamp ネジを締め、反対側に黒い色のバンドが見えるまでホルダーに押し込みます。プランジャーには触れないでください。
   2. clを締めますamp ネジ。胚の下の余分な1cmのアガロースを毛細血管から押し出し、それを切断します。ステムをサンプルホルダーディスクに挿入します。
   3. ソフトウェアで、顕微鏡ステージがロード位置にあることを確認します。ガイドレールを使用して、サンプルが垂直に下向きに顕微鏡に入った状態でホルダー全体を滑らせます。マグネットホルダーディスクが所定の位置にロックされるように、回します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ライトシートZ.1顕微鏡	カールツァイス顕微鏡
低融点アガロース	ロス	6351.1
低融点アガロース	シグマ	A4018 または A9414
3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸(MESAB/MS-222/トリカイン)	シグマ	E10521
20 μl (内径 1 mm、黒印) キャピラリ	ブランド	701904	Transferpettorのスペアパーツとして販売
テフロンチッププランジャー(20μlキャピラリー用	ブランド	701932	Transferpettorのスペアパーツとして販売