層状寒天マウント:倒立顕微鏡による長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚の調製

要約

出典:Upadhyay S., et.al.ゼブラフィッシュの全胚の長時間のタイムラプス共焦点顕微鏡法のための層状マウント法。J. Vis. Exp.(2020年)。

この記事では、生きたゼブラフィッシュの胚を長期間のイメージングのためにマウントする方法について説明しています。この方法は費用対効果が高く、倒立顕微鏡でのイメージングに通常のガラス底顕微鏡ディッシュを使用して簡単に実行できます。埋込みは、異なる濃度のアガロースの層で行われます。

プロトコル

>1. 胚の準備

1. 交配後、E3の胚をペトリ皿で採取し、26.5°Cで約28時間インキュベートしてからマウントします><。 手記： これにより、胚の発育が遅くなり、イメージングの開始時に胚が約30体節段階になります。
2. E3の0.016-0.020%トリカインで胚を麻酔します。色素沈着を抑制するには、PTUを200μMの濃度に添加します。
3. 解剖顕微鏡下で鉗子を使用して胚を解剖します。2つの鉗子を使用して、絨毛膜をつかみ、そっと引き離して胚を解放します。

2. アガロースへの取り付け

>注:開発された埋込方法では、必要に応じて0.02%のトリカインとPTUを含むE3に2つの異なる濃度の低融点アガロースが必要です。第1のアガロース溶液は、歪みおよび運動性が最小となる最適な濃度のアガロースを含んでいる。最適化については、以下のステップ5で説明します。

1. 2つの層のアガロース溶液(以下のステップ5で定義される濃度と1%)を65°Cに加熱します。アガロースをマウントする直前に約30°Cまで冷まして、胚が熱によって損傷を受けないようにします。取り付けには、底面ガラスが0番の35mmガラス皿をご使用ください。皿の底に取り付けられたカバーガラスは、胚が置かれる10mmの浅い(深さ約1.2mm)の井戸を作ります
   手記：この場合、運動性と歪みが最も少ない濃度は、0.025〜0.040%のアガロースでした。
2. ガラスピペットまたはマイクロピペットを使用して、デコレーションされた胚を皿の底に向かって側面の1つを静かに置きます。マイクロピペットを使用する場合は、先端の外側部分を切断して、胚に合うように開口部のサイズを大きくします(図1A)。残っているE3はマイクロピペットで慎重に取り出します。
3. 胚を覆うために皿の底に取り付けられたカバーガラスによって作成された小さなウェルに最初のアガロース溶液を追加します(図1B)。アガロースが小さな井戸を覆っているが、あふれないようにしてください。
4. 小さなウェルをカバーガラス(22 mm x 22 mm)(図1C)で覆い、2つのカバーガラスの間に胚が入った狭いアガロース充填スペースを作ります。
5. カバーガラスの上の皿の底全体に1%アガロース溶液の層を置きます(層2)(図1D)。この層が固まると、カバーガラスが所定の位置に保持されます。
6. 皿の残りの部分に3%トリカインを含むE0.02を入れて、システムの水分を保ちます(レイヤー3)(図1E).
   手記：このセットアップでは、カバーガラスと1%アガロースが最下層が希釈されるのを防ぎます。

3. レイヤー1のアガロース溶液の最適化

1. レイヤー 1 のアガロースの最適な濃度を特定するには、マルチスケール グリッド探索アプローチを使用します。0.01%から1%の範囲のアガロース濃度の増加で胚をマウントし、続いて視野内の胚の成長制限と運動性のタイムラプスイメージングを行います。歪みと運動性の両方が最小になる濃度を特定します。
2. アガロースの濃度をさらに最適化するには、ステップ3.1で最適であることが判明した濃度(0.025%、0.028%、0.031%など)に応じて、より細かい範囲のアガロース濃度(例えば、0.025〜0.040%のアガロース)を使用して胚をマウントします。
   手記：私たちの研究室では、最適なアガロース濃度は約0.03%でした。

結果

図1:取り付け方法の説明。(A)35mm皿のガラス底が作った小さな井戸にゼブラフィッシュの胚を加えます。(B)アガロース層1を小さなウェルに加えて、胚を覆います。(C)小さなウェルの上にカバーグラスを慎重に置きます。(D)35mmディッシュの底全体にアガロース層2を追加します。(E)皿にE3を追加します。(F)取り付けセットアップの断面の概略図。(G)最終モンタージュのゼブラフィッシュ胚の顕微鏡画像(対物レンズ5倍)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
低融点アガロース	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ	A9414の	溶解した溶液を4°Cで保存
35mmガラス底皿、0番カバースリップ、ガラス底径10mm	マサチューセッツ州MatTek Corporation	P35GCOL-0-10-C
トリカイン(MS-222)	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ	E10521	溶解した溶液を4°Cで保存
N-フェニルチオ尿素(PTU)	シグマ・アルドリッチ、ミズーリ	P7629	溶解した溶液を-20°Cで保存
DMC4500デジタル顕微鏡カメラ	ライカ	NAの
マイクロカバーガラス 22x22 mm	VWRの	48366 067

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