寒天マウント:長期イメージングのための生きたゼブラフィッシュ胚のマウントの基本的な方法

Abstract

出典:Hagedorn E. J., et al.発生中の胞胚の外科的融合によるパラビオティックゼブラフィッシュ胚の生成。J. Vis. Exp.(2016年)。

このビデオでは、低融点アガロースを使用して生きたゼブラフィッシュの胚を6ウェルプレートにマウントする手順を順を追って説明しています。また、生きた胚の画像を取得し、ソフトウェアを使用して分析するプロセスも提供します。

Protocol

1. 顕微鏡のセットアップ、画像取得、処理、分析

1. 0.8%低融点(LMP)アガロースを調製する:0.8 gのLMPアガロースを100 mLのE3に加え、完全に溶解するまで加熱します。高温の状態で、1 mLのLMPアガロースを37°Cの加熱ブロックで1.5 mLのマイクロチューブに分注します。LMPアガロースは37°Cで溶融したままです。LMPアガロースの1 mLアリコート(37 °C)ごとに4 mg/mL (25x)、pH 7.0トリカイン40 μlを添加します。注:色素株を使用する場合は、0.15% (50x) PTUを各1 mLアリコートに20 μLを加えてください。
   1. 残りのLMPアガロースは、密閉された50 mLチューブに4°Cで数ヶ月間保存します。
2. 胚がすでに存在する 25 ml の E3 に 1 ml の 4 mg/ml (25x)、pH 7.0 トリカインを添加して、画像化するパラバイオティック胚を麻酔します。
3. 胚が真ん中に溜まるように、皿をそっと回します。次に、先端の広いプラスチック製トランスファーピペットを使用して、できるだけ少ない液体で胚を引き上げます。ピペットを直立させ、胚をそっと跳ね返して、ピペットの一番下に落ち着くようにします。
   1. 胚をピペットの底に置き、ピペットの先端をアガロースの表面に軽く触れて、LMPアガロースの1 mLアリコートに移します。余分な液体を移すことは、アガロースを希釈するため避けてください。
4. ピペットから余分な液体を排出した後、ピペットを使用してアガロース内の胚を穏やかに混合し、ピペットを使用してすべてのアガロースと胚をガラス底(No.1.5カバースリップ)の6ウェルプレートのウェルに移します><。 手記：胚をイメージングプレートに移した後は、必ずピペットを廃棄してください。残留アガロースがピペット内部に固まり、その後の使用には効果がなくなります。むしろ、毎回新しいピペットを使用してください。
5. ステレオスコープの下で、木製の柄のティーリング針の端に固定されたゲルローディングピペットチップを使用して、胚をカバーガラスに向かって下に配置し(顕微鏡の対物レンズの作動距離内にあることを確認するため)、イメージングに適した向きにします。
   手記： アガロースが完全に固まるまで、連続して再配置します。パラビオティック胚は、ペアのどの胚を画像化するかに応じてマウントするように注意してください。結合した胚の向きがランダムであることを考えると、一部のペアでは両方の胚を画像化するのが難しい場合があります。このシナリオでは、鉗子と先端の広いプラスチック製トランスファーピペットを使用してアガロースから胚を回収し、別の視点からのイメージングのために再マウントします。
6. アガロースが固まったら、トリカイン(および必要に応じてPTU)を添加した2〜3mlのE3で覆います。
7. 倒立広視野落射蛍光顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡、またはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して胚を画像化します。目的のイメージングに最も適した対物レンズを選択します。全胚の視野には、4倍の対物レンズを使用します。20倍対物レンズなどの高倍率を選択して、特定の組織
   をイメージングします 手記：正立顕微鏡を使用する場合は、LMPアガロース(上記と同様)をガラスカバースリップに取り付けます。ガラスカバースリップを、同じE3-トリカイン-PTUで満たされた真空グリースのリングがあるガラス顕微鏡スライドに反転させます。
8. NIH Image J/FIJI.
   などの無料の画像解析ソフトウェアパッケージを使用して、取得した画像を処理 手記：セグメンテーションとトラッキングアルゴリズムを使用して、細胞数をカウントし、細胞移動や細胞分裂などのダイナミクスを定量化します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMPアガロース(Ultrapure LMP agarose)	インビトゲン	16520100
トリカイン(粉末)(トリカインメタンスルホント、トリカイン-S)	ウエスタンケミカル株式会社	MS 222
イメージングに使用されるガラス底6ウェルプレート	マテック	P06G1.5-20-F
10mlピペットポンプ(緑)(ピペットポンプピペット)	ノバテックインターナショナル	F37898-0000